Negli eucarioti, il DNA è organizzato nel nucleo in una struttura nucleoproteica nota come 'cromatina'. Per lungo tempo la cromatina è stata considerata un semplice sistema di 'impacchettamento', deputato a immagazzinare i quasi 2 m di DNA genomico umano nel ristretto spazio nucleare, caratterizzato da un diametro di circa 10 μm. Solo recentemente la nostra percezione della funzione della cromatina è cambiata, con l'attribuzione di molteplici funzioni, modulate nel tempo e nello spazio.
È infatti noto come la cromatina, già dai suoi primi livelli strutturali rappresenti un ostacolo per il legame alla doppia elica dei fattori trascrizionali e dell'apparato generale della trascrizione, determinando, di conseguenza, una generale inibizione dell'espressione genica. Nelle cellule eucariotiche queste modificazioni strutturali sono mediate da una complessa serie di attività enzimatiche che, modificando post-traduzionalmente le proteine che compongono la cromatina o alterandone l'associazione con il DNA mediante l'idrolisi di ATP, partecipano attivamente alla regolazione trascrizionale. Infine, le proprietà locali della fibra cromatinica possono essere modulate attraverso l'introduzione o l'eliminazione di specifiche proteine strutturali capaci di influenzarne la dinamicità.
La cromatina costituisce, quindi, una piattaforma su cui convergono molteplici segnali biologici che, una volta integrati, determinano risposte molecolari essenziali per una corretta regolazione non solo della trascrizione ma anche di tutti quei processi metabolici che coinvolgono la doppia elica, quali la replicazione, la riparazione e la ricombinazione. In accordo con ciò, molteplici processi cellulari, come la proliferazione e il differenziamento, vengono influenzati da variazioni della struttura cromatinica.
Sarà perciò estremamente importante comprendere quali geni risultino selettivamente deregolati nella cancerogenesi. Questi studi permetteranno lo sviluppo di nuovi e mirati approcci terapeutici (terapia epigenetica). A tale proposito vale comunque la pena ricordare che attualmente sono in uso alcuni inibitori delle istondeacetilasi e delle DNA-metiltransferasi, che sembrano ben tollerati e presentano un'attività clinica efficace contro diversi tipi di neoplasie.
Struttura di Base della Cromatina: Il Nucleosoma
L'unità di base della cromatina è il nucleosoma, costituito da 146 paia di basi (bp) di DNA che si avvolgono per circa due volte intorno a un ottamero di piccole proteine altamente basiche (cariche positivamente), note come 'istoni'. Ogni nucleosoma contiene due molecole di ognuno dei quattro istoni del core (H2A, H2B, H3 e H4), che si organizzano in un tetramero centrale formato da H3 e H4, fiancheggiato da due eterodimeri di H2A e H2B.
Leggi anche: Vital Proteins: Utile o Dannoso?
I nucleosomi, regolarmente spaziati lungo il filamento di DNA, sono separati tra loro da 10÷100 bp di DNA linker (di connessione). Questa configurazione, nota anche come 'fibra da 10 nm' o 'collana di perle', rappresenta il primo livello di organizzazione della cromatina.
Domini Funzionali degli Istoni
Ogni istone del core contiene due distinti domini funzionali: un motivo globulare, C-terminale, altamente conservato, detto histone fold, e un'estremità (coda) N-terminale, unica per ogni specie istonica. Il primo dominio, deputato all'assemblaggio istonico, è implicato sia nella eterodimerizzazione specifica con un altro istone (H2A con H2B, H3 con H4) sia nell'avvolgimento del DNA nucleosomiale. Al contrario, le code N-terminali, apparentemente non strutturate, protrudono all'esterno del nucleosoma e non contribuiscono significativamente alla sua formazione, né alla sua stabilità; sono invece implicate nell'organizzazione delle strutture cromatiniche di ordine superiore mediante l'interazione con altre proteine e nucleosomi.
Istoni Linker e Condensazione della Cromatina
Oltre agli istoni del core, i nucleosomi degli organismi pluricellulari contengono anche una molecola di istone linker, quale H1, che permette l'avvolgimento di altre 20÷30 bp di DNA. Benché la condensazione sia una proprietà intrinseca alla fibra nucleosomiale, la presenza di H1 favorisce la formazione del livello strutturale immediatamente superiore, costituito dalla fibra da 30 nm.
Anche i diversi membri della famiglia degli istoni di connessione, pur non derivando evolutivamente dagli istoni del core, sono caratterizzati da un dominio globulare fiancheggiato da due estremità non strutturate: una breve coda N-terminale e una C-terminale, altamente basica e di circa 100 residui amminoacidici. Studi strutturali hanno permesso di dimostrare come il dominio globulare sia essenziale per il legame dell'istone linker al nucleosoma; in particolare, esso interagisce con il DNA avvolto intorno all'ottamero istonico e non con le proteine del core. Al contrario, la coda C-terminale sembra giocare un ruolo fondamentale nella formazione delle strutture cromatiniche di ordine superiore.
Come precedentemente accennato, esistono molteplici versioni della proteina H1 e queste sono in genere presenti nella maggior parte delle nostre cellule. Esperimenti di genetica condotti su modelli murini hanno permesso di dimostrare come questi diversi sottotipi sono funzionalmente ridondanti e una sostanziale riduzione dei livelli totali di istoni di connessione porta alla morte dei topi in utero.
Leggi anche: La Nostra Opinione su Vital Proteins
Organizzazione Spaziale della Cromatina Condensata
Nonostante oltre venti anni di assidui studi, non si è ancora compreso quale sia la reale struttura della cromatina condensata. L'organizzazione spaziale della fibra da 30 nm, per esempio, viene spiegata da due diversi modelli. Un primo modello propone una struttura solenoidale, in cui 6 nucleosomi consecutivi formano un giro di un'elica che si superavvolge in una spira con un passo di 11 nm. Questa struttura sarebbe determinata e tenuta insieme dalle diverse interazioni tra gli istoni. Un secondo modello, più recente, favorisce una struttura a zig-zag, in cui il legame di H1, producendo un definito angolo di entrata e di uscita del DNA dal nucleosoma, genererebbe una disposizione alternata (a zig-zag) dei nucleosomi.
La compattazione del DNA raggiunta con la fibra da 30 nm è ancora insufficiente per alloggiare l'intero genoma nel nucleo della cellula; intervengono, quindi, altri meccanismi di condensazione che determinano la formazione delle fibre dello spessore di 100÷400 nm, che caratterizzano la cromatina interfasica, o strutture ancora più compatte tipiche del cromosoma metafasico. Sebbene la natura di queste strutture non sia ancora nota, diverse prove sperimentali suggeriscono che la fibra da 30 nm formi delle anse di dimensioni variabili da alcune decine di chilobasi fino a più di 10 megabasi. Queste anse sarebbero poi bloccate alla loro base da un complesso proteico denominato scaffold nucleare.
Rimodellamento della Cromatina e Regolazione Trascrizionale
Qualunque sia l'organizzazione del DNA all'interno della fibra cromatinica, è oggi ben chiaro che essa ostacola il legame di proteine che devono 'leggere' e/o copiare la sequenza nucleotidica, impedendo di conseguenza la trascrizione. Per questo motivo, negli eucarioti, si è evoluta e affermata una complessa serie di proteine capaci di alterare la struttura della cromatina e di regolarne il livello di compattazione. In particolare, queste funzioni vengono svolte da complessi enzimatici che modificano post-traduzionalmente gli istoni o che, mediante l'idrolisi di ATP, alterano la posizione o la struttura dei nucleosomi.
Il processo di trascrizione ha inizio solo se il DNA presente sui promotori è accessibile all'RNA-polimerasi, l'enzima deputato a copiare lo stampo, e ai fattori trascrizionali che ne riconoscono specifiche sequenze; inoltre la doppia elica si deve aprire (denaturare) al passaggio dell'enzima, per richiudersi (rinaturarsi) subito dopo. La struttura della cromatina, già a partire dalla fibra da 10 nm, ostacola tutti questi passaggi indispensabili all'espressione genica, rendendo necessaria la formazione di una struttura più facilmente raggiungibile.
Complessi di Rimodellamento ATP-Dipendenti
Nelle nostre cellule esistono diversi tipi di complessi di rimodellamento ATP-dipendenti che vengono suddivisi in tre famiglie principali, in funzione del tipo di subunità ATPasica; inoltre, all'interno della stessa famiglia l'associazione di questa subunità con diverse proteine porta alla formazione di complessi multiproteici distinti. Inizialmente identificati con analisi genetiche, questi complessi, e in particolar modo quelli appartenenti alla famiglia SWI/SNF e ISWI, sono stati poi largamente studiati in vitro per comprendere le conseguenze del rimodellamento. In vitro possono portare a diversi cambiamenti strutturali, tra i quali possiamo ricordare la distruzione di alcuni contatti tra il DNA e gli istoni all'interno del nucleosoma, lo spostamento di ottameri istonici sia su sequenze fiancheggianti (movimenti traslazionali) sia su molecole di DNA distinte (movimenti in cis e in trans), e un'aumentata accessibilità del DNA nucleosomiale ai fattori di trascrizione.
Leggi anche: Nutrizione Sportiva: L'Importanza delle Proteine
Come fanno questi complessi a catalizzare eventi così diversi? I primi modelli assumevano che il rimodellamento della cromatina avvenisse attraverso la rimozione di istoni appartenenti al nucleosoma. Per esempio, era stato ipotizzato che i complessi della famiglia SWI/SNF utilizzassero l'energia ottenuta dall'idrolisi dell'ATP per rimuovere uno o entrambi i dimeri di H2A-H2B. Recenti studi hanno reso improbabile questa teoria; infatti, il rimodellamento avviene anche su nucleosomi in cui gli istoni sono stati tra loro legati covalentemente. Attualmente i due modelli più accreditati ipotizzano che l'attività di queste proteine si svolga o attraverso un meccanismo di scivolamento dell'intero ottamero istonico, o attraverso la formazione di anse (looping mechanism) sul DNA nucleosomiale.
Secondo il primo meccanismo, l'ottamero istonico si sposta su sequenze nucleotidiche fiancheggianti. In questo modello non si ha un aumento della quantità di DNA accessibile, ma solo un cambiamento delle sequenze esposte; inoltre, esso non può giustificare il rimodellamento di sequenze di DNA in cui i nucleosomi sono strettamente impaccati uno vicino all'altro e, quindi, impossibilitati a scivolare.
Dal momento che la capacità di rimodellare la cromatina è propria delle subunità centrali contenenti il dominio ATPasico, quale ruolo svolgono le altre proteine appartenenti a questi complessi multiproteici? Attualmente si pensa che queste possano avere una duplice funzione: alcune di esse potrebbero regolare l'attività della subunità catalitica, influenzandone l'efficienza, il risultato finale del rimodellamento o la specificità del substrato, mentre altre potrebbero essere deputate al reclutamento dei complessi su specifici promotori.
A questo proposito vale la pena ricordare che in vivo ciascun promotore è caratterizzato da una specifica organizzazione nucleosomiale; è quindi facile ipotizzare che promotori contraddistinti da nucleosomi fortemente impaccati necessitino di complessi capaci di rendere accessibile il DNA attraverso un meccanismo che non richiede lo scivolamento dei nucleosomi. Al contrario, la capacità di spostare traslazionalmente i nucleosomi sarebbe utile su quei promotori contraddistinti da una bassa densità nucleosomiale.
Per quanto riguarda la specificità di reclutamento, diverse evidenze sperimentali fanno presupporre che questa sia mediata dalla capacità di alcuni fattori trascrizionali sequenza-specifici di legare direttamente, e quindi portare sul promotore, un ben definito complesso di rimodellamento. In altre parole, ogni gene avrebbe 'scelto' le proprie modalità di regolazione, in accordo con recenti evidenze biochimiche che testimoniano come ogni sistema richieda, per l'attivazione, un solo specifico complesso di rimodellamento.
Modificazioni Covalenti degli Istoni
La riorganizzazione della posizione dei nucleosomi da parte di complessi di rimodellamento ATP-dipendenti e la modificazione covalente delle proteine istoniche rappresentano due meccanismi centrali nella regolazione dell'attività cromatinica. In accordo con ciò, le cellule eucariotiche sono dotate di un numero straordinariamente elevato di complessi, capaci di introdurre sulle proteine del nucleosoma una vasta serie di cambiamenti post-traduzionali.
L'importanza di questo fenomeno è facilmente apprezzabile se si considera: (a) che prevalentemente le code N-terminali, ma anche alcuni residui del dominio globulare purché situati in una posizione accessibile, possono essere acetilati sulle lisine (K), metilati sulle lisine e le arginine (R), fosforilati sulle serine (S) e le treonine (T), ubiquitinati o sumoilati sulle lisine o ADP ribosilati; (b) che l'espressione genica è influenzata da queste modificazioni e, più in particolare, che in funzione del tipo di modificazione chimica così come del residuo amminoacidico coinvolto si può avere una risposta di tipo attivatorio o repressorio.
Acetilazione e Deacetilazione degli Istoni
Più di quaranta anni fa era stato proposto che l'iperacetilazione dell'estremità N-terminale degli istoni del core fosse coinvolta nell'attivazione dell'espressione genica. L'ipotesi venne rafforzata dalla dimostrazione che in vitro l'acetilazione degli istoni determina un aumento dell'accessibilità del DNA agli enzimi di restrizione e ai fattori trascrizionali. Questo fenomeno veniva spiegato assumendo che tale modificazione, diminuendo la carica netta positiva delle code, ne rendesse più debole l'interazione con il DNA.
Il modello fu confermato quando, nel 1996, venne purificata dal protozoo Tetrahymena la prima istonacetiltransferasi (HAT); la proteina isolata, infatti, era l'omologo del fattore GCN5, un ben noto coattivatore trascrizionale di lievito (una proteina che non lega direttamente il DNA, ma lo fa tramite un altro fattore proteico). Oggi sappiamo che l'acetilazione è un processo reversibile catalizzato da due gruppi di enzimi. Le istonacetiltransferasi trasferiscono dal cofattore acetil-CoA un gruppo acetilico sul gruppo amminico ε delle lisine degli istoni; al contrario, la rimozione del gruppo acetilico è catalizzata dalle istondeacetilasi (HDAC).
La maggior parte delle HAT fa parte di larghi complessi multiproteici che, in analogia con i complessi di rimodellamento ATP-dipendenti, vengono portati specificatamente sui promotori tramite l'interazione con gli attivatori trascrizionali. Analizzando la somiglianza di sequenza, è stato possibile suddividere le HAT in tre famiglie principali, ciascuna caratterizzata da un distinto pattern d'interazione con proteine non istoniche. In vivo, queste formano complessi composti da subunità diverse e, soprattutto, da una differente specificità istonica.
L'analisi di topi transgenici privi di una specifica HAT (per es., p300 o PCAF o GCN5) ha chiaramente dimostrato come la singola eliminazione di diverse istonacetiltransferasi possa portare a diversi difetti di sviluppo, confermando come ciascun complesso sia implicato in una specifica funzione biologica. Anche le istondeacetilasi fanno parte di larghi complessi multiproteici, che in questo caso però sono coinvolti nella repressione trascrizionale.
tags: #proteine #non #istoniche #definizione