Tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso DNA, ma ciascuna cellula utilizza solo una parte di questo grande insieme di istruzioni genetiche. A seconda del tipo cellulare, del momento dello sviluppo e degli stimoli ambientali, una cellula usa infatti solo i geni che contengono le istruzioni necessarie a svolgere precise funzioni. Per indicare questo utilizzo selettivo, si dice che la cellula esprime determinati geni e non altri.
Un gene che contiene le istruzioni per produrre una proteina viene espresso quando viene trascritto, ossia quando viene generata una molecola di RNA messaggero (mRNA) con la stessa sequenza del gene. Una proteina invece è considerata espressa quando l’mRNA che contiene le istruzioni per produrla viene effettivamente utilizzato per tradurre il linguaggio della genetica in quello delle proteine. In pratica, ciascun mRNA è usato come guida per creare una catena di amminoacidi con una precisa sequenza corrispondente. Tuttavia, una cellula che esprime l’mRNA corrispondente a una proteina non necessariamente la produce.
Sapere quali geni e quali proteine sono effettivamente espressi fornisce informazioni sui processi biologici che stanno avvenendo nelle cellule. Da queste informazioni si può per esempio capire quali molecole sono implicate in quali malattie e identificare possibili bersagli per i farmaci.
Analisi dell’Espressione Genica
Per valutare se un gene è espresso in cellule di interesse occorre stabilire se in tali cellule è presente il corrispondente mRNA; ciò può essere fatto con tecniche come il Northern blot o la real-time PCR.
Northern Blot
Una delle prime tecniche messe a punto per l’analisi dell’espressione genica in una cellula è il Northern blot. Utilizzando particolari reagenti, si lisano (ossia si distruggono) le membrane delle cellule e si estrae l’RNA (l’insieme degli mRNA e di altri tipi di RNA). L’RNA purificato viene poi separato nelle molecole di diverse dimensioni mediante elettroforesi su gel di agarosio. In breve, il campione contenente tutti gli RNA viene depositato in un pozzetto ricavato in una mattonella di gel di agarosio.
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Il gel viene quindi messo in un apparato che crea un campo elettrico che lo attraversa da parte a parte. Poiché gli acidi nucleici come l’RNA sono carichi negativamente, le molecole entrano nel gel e si muovono dal polo negativo verso il polo positivo. Siccome le molecole più piccole si muovono più velocemente, le molecole di RNA si separano lungo la dimensione verticale del gel in base alle dimensioni. Una volta bloccata la migrazione, il gel viene posto a contatto con una speciale membrana: grazie al fenomeno fisico della capillarità, l’RNA passa dal gel alla membrana.
La membrana viene quindi messa in incubazione con una sonda radioattiva o luminescente (un frammento di DNA con la sequenza dell’mRNA che si vuole cercare, contenente fosforo radioattivo). La sonda si lega alla membrana in corrispondenza delle molecole di mRNA di interesse. Infine, la membrana viene messa a contatto con una lastra radiografica e la radioattività della sonda impressiona la lastra creando delle macchie nere. Dalle macchie è possibile stabilire se un campione contiene l’mRNA per un determinato gene e se un campione ne contiene più o meno di un altro.
Il Northern blot è una tecnica oggi abbastanza desueta, perché richiede tempi lunghi e l’utilizzo di materiale radioattivo.
Real-Time PCR (RT-PCR)
Al momento, invece, la tecnica più utilizzata per valutare l’espressione genica è la real-time PCR (RT-PCR). Si parte sempre con l’estrazione e la purificazione dell’RNA. Il campione di RNA viene poi usato come stampo per sintetizzare in provetta il suo DNA complementare (cDNA): utilizzando i mattoncini di cui sono fatti gli acidi nucleici (i nucleotidi) e uno specifico enzima (trascrittasi inversa), vengono create delle copie fatte di DNA degli mRNA presenti nel campione.
Il cDNA così ottenuto viene poi utilizzato in una reazione di PCR (polymerase chain reaction). Si mescolano il cDNA, piccoli frammenti di DNA con sequenze specifiche del gene di interesse (primer) e un enzima che sintetizza il DNA (DNA polimerasi). Uno speciale strumento (termociclatore) porta il campione alle temperature idonee perché i filamenti di DNA si separino e possano avvenire le reazioni biochimiche che permettono la sintesi di nuovi frammenti di DNA.
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Ogni ciclo di PCR genera 2 molecole di DNA per ogni molecola che fa da stampo. Il processo è esponenziale: se all’inizio c’erano 2 molecole di cDNA (e quindi, originariamente, di mRNA) per il gene di interesse, dopo un ciclo se ne ottengono 4, dopo due cicli 8 e così via. Nella real-time PCR, la miscela di reazione contiene una molecola fluorescente che si inserisce nel DNA di nuova sintesi. Lo strumento misura la fluorescenza del campione, proporzionale alla quantità di DNA sintetizzato, man mano che si susseguono i cicli di reazione (real time significa in tempo reale). Quantificando il segnale fluorescente si può stabilire se un campione conteneva l’mRNA di interesse e confrontare l’espressione del gene in campioni diversi.
Le macchine per la real-time PCR possono analizzare molti campioni alla volta, anche alcune centinaia se il processo è automatizzato. Utilizzando primer diversi si possono studiare più geni contemporaneamente in tempi ridotti.
Se si vogliono valutare con un singolo esperimento tutti gli mRNA espressi dalle cellule, ossia il loro trascrittoma, si utilizzano tecniche come i microarray e l’RNA-seq (vedi scheda sulla trascrittomica).
Analisi dell’Espressione delle Proteine
Per valutare se una proteina è prodotta in cellule di interesse occorre verificarne la presenza con tecniche come il Western blot, l’ELISA o la citometria a flusso.
Western Blot
Per quanto riguarda l’analisi dell’espressione delle proteine delle cellule di interesse, la tecnica di laboratorio maggiormente usata è il Western blot. Per prima cosa si lisano le membrane delle cellule con una soluzione che contiene sodio dodecilsolfato (SDS), una molecola organica che si lega alle proteine linearizzandole, cioè distruggendone la fisiologica struttura tridimensionale data dalla sequenza degli amminoacidi. Le proteine vengono poi separate mediante elettroforesi su gel di acrilammide: si produce un gel di acrilammide dello spessore di pochi millimetri facendolo solidificare tra due lastre di vetro e a un’estremità si formano dei pozzetti in cui si depositano i campioni.
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Il gel è quindi messo in un apposito apparato che crea un campo elettrico in grado di attraversare il gel per il lungo, da parte a parte. Poiché l’SDS dà alle proteine una carica negativa, esse si muovono nel gel verso il polo positivo. La distanza percorsa nel gel dipende dalla lunghezza di ciascuna proteina e proteine più piccole si muovono più velocemente. Le proteine si separano quindi in base alle dimensioni.
Il gel viene poi posto a contatto con una speciale membrana. Sfruttando un campo elettrico generato da un altro apparato, le proteine vengono così trasferite dal gel alla membrana. La membrana viene quindi messa in incubazione con un anticorpo (anticorpo primario) che riconosce soltanto la proteina di interesse. A questa segue una seconda incubazione con un altro anticorpo (anticorpo secondario) che riconosce gli anticorpi primari immobilizzati sulla membrana. L’anticorpo secondario è coniugato a un enzima capace di catalizzare una reazione chimica che emette luce (chemiluminescenza) quando viene fornita l’apposita molecola reattiva (substrato).
Dopo avere attivato la chemiluminescenza, la membrana viene messa a contatto con una lastra fotografica e la luce emessa impressiona la lastra creando delle macchie nere in corrispondenza della proteina di interesse. Oggi in genere al posto delle lastre fotografiche si utilizzano dei sistemi di imaging in grado di convertire il segnale luminoso in un segnale digitale, che può essere registrato e analizzato da un computer.
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
È possibile valutare se le cellule esprimono una proteina solubile (ossia che viene rilasciata all’esterno della cellula) raccogliendo un campione del liquido in cui sono state fatte crescere le cellule e analizzandolo con il test ELISA (ELISA sta per “enzyme-linked immunosorbent assay”). Come il Western blot, anche questo test immunoenzimatico si basa sul riconoscimento di una proteina di interesse da parte di un anticorpo specifico. In breve, l’anticorpo primario è immobilizzato sul fondo di una piastra multipozzetto. Si deposita il campione in un pozzetto così che la proteina si leghi al suo anticorpo corrispondente. Ogni piastra può contenere fino a un centinaio di campioni. Si lava via ciò che non si è legato e si riempiono i pozzetti con una soluzione contenente un anticorpo secondario coniugato a un particolare enzima.
Dopo ulteriori lavaggi, si riempiono i pozzetti con una soluzione di un substrato che quando viene modificato chimicamente dall’enzima cambia colore. Quindi, con uno strumento chiamato spettrofotometro si misura l’intensità del colore e, confrontandola con quella del colore sviluppato nei pozzetti dove sono state messe quantità note della proteina di interesse, non solo è possibile dire se la proteina è espressa, ma anche quanta ne viene prodotta.
Citometria a Flusso
Per valutare l’espressione di proteine presenti sulla membrana esterna delle cellule o di proteine solubili è anche possibile usare la citometria a flusso.
Analisi delle Proteine negli Integratori Alimentari
L’analisi delle proteine è essenziale per determinare la qualità del prodotto e le sue prestazioni e interpretazione adeguate sono fondamentali per il rilevamento delle frodi.
Importanza delle Proteine in Polvere
È innegabile che la proteina in polvere sia un prodotto di altissima qualità nutritiva e che faciliti il consumo di questo nutriente in situazioni di inappetenza o difficoltà di masticazione (ad esempio negli anziani), oppure semplicemente per facilità di trasporto e preparazione del prodotto. Il problema appare quando alcune aziende di integratori non giocano in modo corretto e fingono di vendere uno spasso.
Importanza dell’Analisi delle Proteine
Il boom registrato nella vendita di integratori proteici ha segnato un prima e un dopo in questo mercato. La competitività esistente tra i produttori significa che vengono offerte sempre più offerte e i prezzi vengono adeguati al massimo, non sorprende che i casi di frode sui prodotti abbiano messo a dura prova il settore, costringendolo a pagare solo per i peccatori in molte occasioni. Per questo motivo, è già un obbligo fornire informazioni chiare, basate su test di laboratorio e specificando la metodologia utilizzata. La “adulterazione economica” è definita come la sostituzione fraudolenta di un componente autentico o naturalmente presente nel cibo con un componente non autentico più economico, con l’unico scopo di guadagnare più denaro.
Perché realizzare l’Analisi delle Proteine?
- Stabilire il valore di mercato dei prodotti proteici.
- Valutare la qualità degli ingredienti a base di proteine.
- Notificare la conformità degli ingredienti sia per il consumatore che per il venditore, nonché per gli aspetti normativi.
- Determinare l’autenticità degli alimenti e degli ingredienti proteici.
- Analizzare il contenuto nutrizionale degli alimenti per l’etichettatura.
Strategie per rilevare le frodi alimentari
Esistono due approcci principali per identificare potenziali frodi nell’industria alimentare:
- Analisi delle sostanze adulteranti: In questo caso, il risultato positivo sarebbe l’assenza di un materiale specifico. Il problema con questo approccio è che queste sostanze devono essere conosciute in anticipo. Cioè, se è adulterato con qualsiasi componente per il quale l’analisi non è progettata, passerebbe inosservato.
- Analisi della purezza degli ingredienti: Questa strategia è efficace quando l’adulterante viene aggiunto in quantità sufficientemente elevate da rilevare una mancanza di purezza del materiale originale. Tenendo conto che, normalmente, l’obiettivo è ridurre i costi di produzione, i materiali indesiderati verranno aggiunti in proporzioni elevate. Questa strategia è solitamente la più appropriata.
Fondamenti delle Analisi delle Proteine
Sebbene esistano numerose tecniche per analizzare il contenuto proteico dei prodotti alimentari, in questo articolo ci concentreremo sulla spiegazione delle analisi che possono essere più frequenti nel contesto degli integratori sportivi.
Informazioni sulle proteine nell’etichettatura
Normalmente, possiamo trovare 3 tipi di informazioni riguardanti le proteine sull’etichettatura di un prodotto o integratore:
- Fonte o fonti da cui provengono queste proteine: indicate nella lista degli ingredienti.
- Quantità di proteine: è indicata nella tabella nutrizionale.
- Profilo amminoacidico della proteina: Aminogramma.
Scopo dell’analisi
L’obiettivo dell’analisi di laboratorio sarà quindi determinare la quantità di proteine e amminoacidi in una data fonte di cibo.
Determinazione del contenuto proteico totale
A tal fine, i metodi più comuni si basano sulla determinazione del contenuto di azoto totale e sull’estrapolazione di questi dati alla quantità di proteine totali, attraverso l’uso di determinati fattori di conversione. Cioè, sono metodi indiretti. Questa strategia si basa sul principio che le proteine sono gli unici nutrienti che forniscono azoto nella dieta. Il problema è che oggi sappiamo che esistono composti non proteici che forniscono anche azoto. Questi possono ingrandire il risultato di questi test, portando a una sovrastima del contenuto proteico.
”Amino Spiking”
Questo è il motivo principale per cui questi metodi di rilevamento dell’azoto totale non sono affidabili per rilevare frodi. Una delle truffe più comuni è “l’amino spiking”, che passa inosservato in queste tecniche. In modo semplificato, l’amino spiking consiste nell’aggiungere uno o più aminoacidi economici (gli amminoacidi contengono azoto) a una base proteica a bassa purezza. Quando viene determinato l’azoto totale, il risultato offrirebbe la somma dell’azoto della proteina con l’azoto degli amminoacidi e creerebbe una falsa idea che il contenuto proteico sia elevato.
Metodi di rilevamento dell’azoto totale
Kjeldahl
Si basa su 4 passaggi in base ai quali il campione viene digerito in modo da poter misurare l’azoto che fornisce (sia da fonti proteiche che non proteiche). Per fare ciò, questo azoto viene convertito in ammoniaca, che viene isolata attraverso un processo di distillazione. Successivamente, il contenuto di azoto totale viene determinato indirettamente, attraverso una serie di reazioni chimiche. La sua principale debolezza risiede nella mancanza di differenziazione tra contenuto proteico e non proteico. Per risolvere questo problema, esiste un precedente processo di precipitazione delle proteine, che consente di isolarle e determinare esclusivamente l’azoto proteico. Questo metodo Kjeldahl è noto come ”true protein”.
Dumas o metodo di combustione
La sua base si basa sulla formazione di sostanze gassose a seguito della combustione del campione. Questo produce, tra gli altri, NOx e N2. Dopo aver ridotto gli NOx a N2, viene determinato l’N2 totale. Attualmente sono disponibili analizzatori di azoto che semplificano, abbassano il prezzo e sono più sicuri e veloci delle procedure tradizionali basate sul Kjeldahl. Il problema però è simile a quello del Kjeldahl, non consente la differenziazione tra azoto proteico e non proteico, quindi è suscettibile di adulterazioni.
Fattori di conversione
Come abbiamo commentato in precedenza, la determinazione dell’azoto presuppone un passaggio precedente per stabilire successivamente il contenuto proteico. Il fattore 6.25 è stato tradizionalmente utilizzato per calcolare la quantità di proteine dai valori di azoto. Si basa sul presupposto che il contenuto di azoto delle proteine sia del 16%. Tuttavia, la realtà è diversa ed è che il contenuto di azoto varia a seconda del tipo di proteina, poiché la composizione degli amminoacidi è diversa. Nonostante i suoi limiti, i fattori più utilizzati sono quelli proposti da Jones nel 1931.
Limitazioni: Nonostante l’ampiezza di questi fattori, è stato osservato che a seconda dello studio e della metodologia, possono verificarsi forti oscillazioni, anche quando viene analizzato lo stesso tipo di proteina. Un altro limite importante è l’applicazione del fattore 6.25 quando il fattore specifico di una fonte proteica non è noto, in quanto ciò può portare a una stima eccessiva o insufficiente del contenuto proteico. Tuttavia, in assenza di altri metodi validati, tenendo conto che anche la FAO considera validi questi fattori, e che il dibattito sulla loro precisione non rientra negli obiettivi di questo articolo, li accetteremo come referenze.
L’importanza dell’aminogramma
In considerazione del fatto che i metodi di analisi dell’azoto totale sono abbastanza sensibili alle manipolazioni, abbiamo bisogno di strategie più precise e che permettano di smascherare possibili frodi.
Qual è l’aminogramma di una proteina?
L’aminogramma non è altro che la scomposizione e la quantificazione degli amminoacidi che compongono una proteina. La sua determinazione ci consente due tipi di analisi delle proteine:
- Qualitativa: a causa della differenziazione di ciascuno degli amminoacidi.
- Quantitativa: aggiungendo le quantità di ogni amminoacido possiamo ottenere la quantità totale di proteine.
Per poter interpretare rigorosamente l’analisi di un aminogramma, è necessario conoscere preventivamente il profilo amminoacidico della proteina o del campione, in modo da fare un confronto tra il valore ottenuto e il valore che teoricamente dovrebbe registrare.
Esempio di aminogramma
Facciamo un semplice esempio: per una proteina del siero di latte e l’aminoacido glicina. Sulla base della letteratura e delle precedenti analisi di laboratorio, sappiamo che per ogni 100 g di prodotto, l’isolato di proteine del siero di latte ha una concentrazione di glicina che può variare tra 1,6 - 1,8 grammi. Se si analizza l’aminogramma e si osserva che per ogni 100 g di prodotto il contenuto di glicina sale al di sopra di tale intervallo, sapremo che questa proteina è stata adulterata aggiungendo questo amminoacido o mescolandolo con un’altra proteina più economica. Se solo il contenuto di azoto totale fosse stato analizzato utilizzando i metodi Dumas o Kjeldahl, questa alterazione sarebbe stata praticamente non rilevabile.
Come possiamo analizzare l’aminogramma di una proteina?
Senza dubbio, una delle tecniche più appropriate a questo scopo è l’HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Con l’HPLC ottieni qualcosa di simile a questo grafico: Prima dell’analisi, il campione viene preventivamente trattato, in modo che sia consentita la rilevazione individuale di ciascun amminoacido. Il fondamento della tecnica, a un livello molto elementare, si basa sul fatto che ogni amminoacido ha proprietà differenti a livello fisico-chimico e, variando le condizioni dell’analisi, è consentita la rilevazione sequenziale di questi amminoacidi. Ogni picco corrisponde a un amminoacido e l’area sotto la curva di ciascun picco consente di determinare la concentrazione di quell’amminoacido.
Interpretazioni delle analisi di HSNstore.com
Lo scopo non è altro che mostrare che non esistono imbrogli, poiché come sai la trasparenza è una delle nostre massime.
Accreditamento ENAC
Tali analisi non sono state eseguite da noi, ma da un laboratorio indipendente, che dispone anche dell’accreditamento dell’Ente Nazionale di Accreditamento. In effetti, il suo timbro si trova sui documenti dell’analisi. Testualmente l’ENAC definisce l’accreditamento come: “lo strumento istituito a livello internazionale per generare fiducia sulla corretta esecuzione di una tipologia di attività denominate Attività di Valutazione della Conformità e che includono test, calibrazione, ispezione, certificazione o verifica tra gli altri”. Per riassumere, è un modo per garantire che l’ente accreditato rispetti una serie di requisiti, solitamente dettati da normative internazionali come gli standard ISO, UNE o EN. Cioè, devono soddisfare gli standard di qualità accettati a livello mondiale.
Esempio di Analisi delle Proteine HSN: 100% Whey Protein Isolate
Per questo useremo l’analisi dell’isolato di proteine del siero di latte come esempio.
Contenuto della proteina
Prima di tutto, vedremo qual è il contenuto proteico totale secondo le analisi. Partendo dall’alto, troviamo la descrizione o riferimento del prodotto e il relativo lotto.
Metodo utilizzato
Per quanto riguarda la metodologia utilizzata, possiamo vedere che è stato applicato il metodo Dumas spiegato sopra. Per determinare il contenuto di azoto totale, moltiplicarlo per i fattori 6,25 o 6,38 e ottenere il valore proteico.
Materia secca
Infine, possiamo vedere il valore proteico nella sostanza secca contrassegnato in rosso dopo aver moltiplicato per 6,38. Come abbiamo visto prima, è il fattore di conversione utilizzato nel caso delle proteine di origine casearia.
Incertezza
Secondo questa analisi, il valore della proteina è 90,22%, anche se dobbiamo tenere presente che questo valore viene raccolto come una media. Pertanto, può variare di una certa percentuale. Questa variazione è nota come incertezza. In questo caso, l’incertezza per questo valore è ± 3.791; Ciò significa che i risultati possono variare tra 86,43% e 94,01%.
Confronto con la tabella nutrizionale
Se guardiamo da vicino, questi dati corrispondono perfettamente alla quantità di proteine riportata sulla nostra etichetta: 93 g per ogni 100 g di prodotto, cioè 93%.
E l’Aminogramma?
Ma ovviamente, se hai capito bene l’articolo, potresti pensare che il metodo Dumas non funziona per smascherare le frodi. E quel 93% può essere il risultato di qualsiasi tipo di adulterazione. Tranquillo, per questo presentiamo anche l’analisi degli amminoacidi di questa proteina.
Analisi HPLC
Focalizzandosi sull’analisi, la metodologia utilizzata è quella dello standard internazionale ISO 13903: 2005, o che è lo stesso, l’HPLC. Come abbiamo visto, con questa tecnica è facile identificare le frodi. La prima prova Per verificare che il valore proteico fornito sopra sia reale.