Le proteine sono macromolecole biologiche di grandissima importanza, le più presenti nel nostro organismo, e svolgono la maggior parte delle funzioni che lo mantengono in vita. Esse possono svolgere funzione strutturale, immunitaria, trasporto (di ossigeno, minerali, lipidi, di membrana), di identificazione dell'identità genetica, ormonale, enzimatica, contrattile, energetica. Infatti, con l'eccezione di alcuni tipi di RNA, la maggior parte delle altre molecole biologiche sono elementi relativamente inerti su cui agiscono le proteine.
Come si Formano le Proteine?
Negli anni cinquanta del XX secolo, Francis Crick, considerando il problema del rapporto funzionale fra DNA e proteine, formulò il dogma centrale della biologia molecolare, secondo il quale in biologia molecolare il flusso dell'informazione genetica è monodirezionale: parte dagli acidi nucleici per arrivare alle proteine, senza considerare un percorso inverso (tranne alcune eccezioni). In parole semplici, il dogma afferma che il gene è un tratto di DNA contenente le informazioni per la produzione di una catena polipeptidica; la proteina però non contiene l’informazione per la produzione di altre proteine, dell’RNA o del DNA.
Per spiegare in che modo l'informazione contenuta nel DNA passa dal nucleo al citoplasma, è necessario ipotizzare che da un filamento di DNA di un particolare gene si formi per copia complementare una molecola di RNA (processo di trascrizione). L'RNA messaggero o mRNA si sposta poi dal nucleo al citoplasma dove a livello dei ribosomi, serve da stampo per la sintesi delle proteine. Ma per spiegare in che modo una sequenza di DNA si trasforma nella sequenza di amminoacidi specifica di un polipeptide, deve esistere una molecola adattatrice capace di legarsi in modo specifico a un amminoacido, di riconoscere una sequenza di nucleotidi e provvista di due regioni, una che svolge la funzione di legame e l'altra che svolge la funzione di riconoscimento. Tali molecole adattatrici sono quelle dell'RNA transfer o tRNA. Gli adattatori di tRNA, che portano gli amminoacidi, si allineano lungo la sequenza dell'mRNA in modo tale che gli amminoacidi si vengono a trovare nella sequenza giusta per la crescita di una catena polipeptidica (un processo chiamato traduzione).
Per mettere in relazione la sequenza dell'mRNA (e quindi del gene) con gli amminoacidi che compongono le proteine, occorre poi un codice genetico. Il codice genetico specifica l'acido da utilizzare di volta in volta per costruire una proteina. L'informazione contenuta nella molecola di mRNA può essere vista come una serie lineare di parole di tre lettere (formate dalle basi uracile U, citosina C, adenina A e guanina G) che vanno appunto tradotte in proteine. Ogni sequenza di tre basi (le tre lettere) lungo la catena polinucleotidica dell'RNA è un'unità di codice, o codone, e specifica un particolare amminoacido. Esistono 61 triplette diverse che sintetizzano per i 20 amminoacidi e 3 codoni di stop.
Trascrizione e Traduzione
La sintesi proteica, nota anche come biosintesi delle proteine o traduzione, è il processo responsabile della produzione di proteine nelle cellule viventi, basandosi sull'informazione genetica contenuta nella sequenza nucleotidica dell'mRNA e, indirettamente, del DNA da cui l'mRNA è stato codificato. La traduzione, uno dei processi più conservati in tutti gli organismi viventi, è il processo cellulare più complesso per numero di componenti e di interazioni molecolari implicate e impegna una gran parte delle risorse energetiche della cellula. Infatti, l'apparato di sintesi proteica include, oltre all'mRNA e ai ribosomi (costituiti da 50-80 diverse proteine e vari RNA ribosomiali), anche più di trenta tipi di tRNA (RNA transfer o di trasferimento), una ventina di enzimi implicati nell'attivazione degli amminoacidi, numerosi fattori proteici necessari per le fasi di inizio, allungamento e terminazione della traduzione. In una cellula procariotica ci sono circa 20.000 ribosomi e 200.000 molecole di tRNA per tradurre 1000-2000 molecole di mRNA; in complesso, tra il 30 e il 50% del peso secco di una cellula procariotica è dedicato alla sintesi proteica.
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La sintesi proteica consiste nella costruzione di proteine da parte del ribosoma che, con l'ausilio di altri componenti dell'apparato di traduzione, scorre sull'mRNA decifrandone l'informazione codificata e catalizza l'aggiunta progressiva di amminoacidi, uno alla volta, alla catena proteica nascente. L'mRNA viene 'letto' dai ribosomi sempre nella direzione 5′→3′, mentre la proteina viene sintetizzata sempre nella direzione ammino→carbossiterminale. La velocità di allungamento della catena amminoacidica è di circa venti amminoacidi al secondo nei procarioti ed è quasi dieci volte inferiore negli eucarioti. L'efficienza della produzione di proteine è inoltre aumentata dal fatto che più ribosomi possono legarsi in successione allo stesso mRNA e procedere in fila lungo lo stesso formando così un 'polisoma'.
Lo studio del meccanismo molecolare della sintesi proteica ha recentemente fatto un salto di qualità grazie alla straordinaria impresa scientifica e tecnologica che ha portato alla risoluzione a livello atomico della struttura del ribosoma. Ciò ha permesso infatti il passaggio da una descrizione alquanto schematica e superficiale delle strutture e interazioni molecolari coinvolte nella traduzione al loro studio e alla loro comprensione a livello molecolare molto più fini, compiti che terranno ancora impegnati molti gruppi di ricerca nei prossimi anni. In questa sede si tratteranno prima i principali componenti dell'apparato di traduzione (ribosomi, tRNA, mRNA) per passare poi alla descrizione del meccanismo distinguendo per convenienza le tre fasi, di inizio, di allungamento e di terminazione, sempre confrontando i processi nei procarioti e negli eucarioti.
Trascrizione e traduzione sono due processi distinti ma interconnessi. La trascrizione, cioè la formazione diretta di uno specifico RNA a partire da uno specifico DNA, richiede uno stampo di DNA, i corretti ribonucleotidi trifosfati (ATP, GTP, CTP e UTP) che facciano da substrato e un grande enzima chiamato RNA polimerasi che va a coprire un tratto di DNA pari a circa 50 basi. Attraverso questo processi non viene prodotto solamente l'mRNA che conterrà l'informazione per la sintesi proteica, ma anche il tRNA e l'rRNA (RNA ribosomiale), essendo tutti, come i peptidi, codificati da geni specifici. La trascrizione si svolge in tre tappe: inizio, allungamento, terminazione. Nella fase di inizio l'RNA polimerasi si lega ad un promotore (una sequenza di DNA situata nei pressi dell'estremità 5' della regione che codifica una proteina) tramite fettori di trascrizione di natura proteica ed inizia a svolgere e srotolare i filamenti di DNA. Il DNA parzialmente srotolato funge quindi da stampo per la sintesi di RNA, viene infatti letto nella fase di allungamento dalla RNA polimerasi in direzione 3'-5' e si produce il trascritto di RNA aggiungendo nucleotidi all'estremità 3'. Nell'ultima fase, quando l'RNA polimerasi raggiunge il sito di terminazione, il trascritto di RNA si stacca dallo stampo.
Una volta che l'informazione genetica è stata trascritta su un filamento di mRNA, questo esce dal nucleo nel citoplasma, e si reca nei ribosomi dove avviene il processo di traduzione. Qui, per consentire la traduzione delle informazioni in proteine, è necessaria la presenza, oltre che dell'mRNA e del ribosoma, anche di tRNA, enzimi, vari fattori, ATP e naturalmente amminoacidi.
I Componenti Chiave della Traduzione
Già dagli anni 1940-1950 era stata osservata una stretta correlazione tra la quantità di RNA nelle diverse cellule e la loro capacità di sintesi proteica, il che suggeriva un ruolo diretto dell'RNA nella sintesi proteica. Negli anni successivi, l'introduzione dell'uso di radioisotopi (in particolare 14C) per studiare l'incorporazione di amminoacidi nelle proteine di nuova sintesi e l'uso di metodi di microscopia elettronica e di ultracentrifugazione hanno permesso di identificare piccole particelle dense contenenti RNA, in parte libere nel citoplasma e in parte attaccate al reticolo endoplasmatico, che venivano indicate con vari nomi quali 'granuli basofili', 'microsomi', 'nucleoproteine' e altri. Divenne presto chiaro che questo componente particolato rappresentava la sede della sintesi proteica.
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Ribosomi
I ribosomi sono delle 'macchinette' molecolari che sintetizzano le proteine decodificando l'informazione portata dall'mRNA. Nonostante alcune differenze di grandezza e composizione che si riscontrano tra ribosomi di varie specie, le loro struttura e funzione sono rimaste altamente conservate durante l'evoluzione. Tutti i ribosomi procariotici ed eucariotici sono particelle ribonucleoproteiche, cioè sono composti da RNA e proteine assemblati a costituire due subunità ribosomali distinte, una maggiore e una minore. I ribosomi e le loro subunità vengono generalmente denominati in base alla loro velocità di sedimentazione, misurata mediante ultracentrifugazione ed espressa in unità Svedberg. Così i ribosomi procariotici vengono chiamati 70S perché hanno una velocità di sedimentazione di 70 Svedberg, mentre quelli citoplasmatici eucariotici, che sono un po' più grandi e sedimentano più velocemente, vengono chiamati 80S. Come schematizzato nella fig. 2, i ribosomi procariotici 70S sono costituiti dalle due subunità chiamate 50S e 30S, e quelli eucariotici 80S dalle subunità 60S e 40S. Va notato che i valori in S delle subunità non sono additivi rispetto a quelli dei ribosomi interi, perché la velocità di sedimentazione dipende non solo dalle dimensioni ma anche dalla forma e non è quindi una misura della massa. La fig. 2 mostra anche come ciascuna subunità sia costituita da una o più molecole di rRNA e da numerose r-proteine (proteine ribosomali). La subunità 30S dei ribosomi procariotici contiene l'rRNA 16S costituito da circa 1540 nt (nt = nucleotidi) e 21 r-proteine diverse (chiamate S1, S2, S3, ecc.), mentre la subunità 50S contiene l'rRNA 23S (2900 nt), il piccolo RNA ribosomale 5S (120 nt) e 34 r-proteine (chiamate L1, L2, L3, ecc.). Nel complesso la massa del ribosoma procariotico è di circa 2500 kDa ed è costituita per circa metà da RNA e metà da proteine. Come si può vedere nella fig. 2, il ribosoma eucariotico è simile a quello procariotico, ma ha rRNA più lunghi, un numero maggiore di proteine e di conseguenza anche una massa maggiore, pari a circa 4200 kDa.
Va detto che le cellule eucariotiche contengono, oltre ai tipici ribosomi 80S citoplasmatici, anche ribosomi all'interno dei mitocondri e, nel caso delle piante, anche nei cloroplasti. Questi ribosomi sono per vari aspetti più simili ai 70S procariotici che non agli 80S eucariotici, a ricordarci l'origine di questi organelli come endosimbionti procariotici. Il numero di ribosomi per cellula è molto variabile a seconda del tipo di cellula e delle sue condizioni di crescita. Capire a fondo il meccanismo della sintesi proteica comporta la conoscenza dettagliata della struttura dei ribosomi. Quattro decenni di lavoro di numerosi gruppi di ricerca che hanno utilizzato varie tecniche progressivamente più complesse e raffinate, hanno portato nel 2001 alla risoluzione a livello atomico della struttura del ribosoma 70S.
È interessante notare che questi importanti studi strutturali sono stati fatti su ribosomi preparati da organismi estremofili, quali Th. Come si può osservare nella fig. 3A, gli rRNA 16S e 23S assumono strutture specifiche secondarie per appaiamento intramolecolare di basi complementari. Essi si ripiegano poi in precise strutture tridimensionali (fig. 3B). Nella struttura delle subunità ribosomali gli rRNA costituiscono una specie di impalcatura su cui si assemblano le r-proteine (fig. 3C); alcune di queste stabiliscono legami forti direttamente con l'rRNA, mentre altre vi si legano solo dopo che si sono legate le prime. Nel complesso le r-proteine tendono a trovarsi nella parte esterna del ribosoma e presentano spesso prolungamenti che si infilano nella struttura dell'rRNA.
Il ribosoma contiene siti di legame per gli altri componenti dell'apparato di traduzione, l'mRNA e il tRNA, e per la catena proteica nascente. Come indicato, la subunità minore del ribosoma contiene un canale in cui scorre l'mRNA, mentre il sito di uscita della catena peptidica nascente è costituito da un tunnel che attraversa la subunità maggiore. Ci sono tre siti di legame per tRNA: il sito A (amminoacilico o accettore) che lega il tRNA amminoacilato in ingresso, il sito P (peptidilico) che lega l'ultimo tRNA entrato e porta la catena peptidica nascente, e il sito E (exit) che lega il tRNA ormai scarico che deve essere rilasciato. I siti A e P si trovano all'interfaccia tra le due subunità, cosicché ciascuno di essi è composto di due emisiti, uno nella subunità minore e uno nella subunità maggiore del ribosoma. I tRNA sono posizionati in modo che gli anticodoni, che si trovano all'estremo del braccio lungo della struttura a L dei tRNA, si possano appaiare con i codoni dell'mRNA nella subunità minore del ribosoma, in quello che viene chiamato 'centro di decodificazione'.
tRNA
Innanzitutto il tRNA è una molecola che grazie alla sua particolare struttura è in grado di “caricarsi” di un amminoacido, leggere i codoni dell'mRNA ed associarsi con esso, e quindi fornire gli amminoacidi corrispondenti ai codoni letti interagendo con il ribosoma. Nel ribosoma si riconoscono tre siti di legame per il tRNA, il sito A, di attacco, dove l'anticodone del tRNA carico si lega al codone dell'mRNA, il sito C, di condensazione, dove il tRNA cede il proprio amminoacido alla catena polipeptidica in crescita, e il sito D, di distacco, dove viene a trovarsi il tRNA che ha ormai consegnato il proprio amminoacido, prima di staccarsi dal ribosoma e tornare nel citosol a raccogliere un'altra molecola di amminoacido e ricominciare il processo.
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Verso la fine degli anni Cinquanta del Novecento Francis Crick ipotizzò l'esistenza di 'adattatori' molecolari in grado di riconoscere da una parte i codoni (triplette di nucleotidi) del messaggio genetico e dall'altra parte gli specifici amminoacidi da inserire nella sequenza delle proteine. Negli stessi anni era stata scoperta una classe di piccole molecole di RNA, che si rivelarono presto essere gli adattatori ipotizzati e che sono ora chiamati tRNA (RNA transfer o di trasferimento). In ogni cellula esiste almeno un tipo di tRNA per ciascuno dei venti tipi di amminoacidi utilizzati nella sintesi proteica, ma spesso ve ne è più di uno. Tutti i tRNA sono piccole molecole costituite da una sequenza di 75÷90 nt. Alcune regioni della sequenza sono conservate nei diversi tRNA, altre sono specifiche per ciascuno di essi. La struttura del tRNA presenta una caratteristica struttura secondaria a trifoglio risultante dall'appaiamento di basi complementari tra diverse regioni della molecola. Riconosciamo nella struttura uno stelo, formato dalle due estremità della molecola, su cui si legherà l'amminoacido specifico, e tre anse. Di queste, quella centrale, opposta allo stelo, contiene l'anticodone, cioè la sequenza di tre nucleotidi che riconosce, per appaiamento di basi, il codone del messaggio genetico.
In effetti i tRNA non possono da soli svolgere il ruolo di adattatori molecolari ipotizzato da Crick. Infatti, mentre essi sono in grado di riconoscere direttamente (seppure con l'aiuto del ribosoma) il codone mediante interazioni specifiche codone-anticodone, non hanno però alcuna diretta affinità specifica per gli amminoacidi che devono caricare. Come i tRNA, le amminoacil-tRNA-sintetasi sono come minimo venti, essendone necessaria almeno una per ciascun tipo di amminoacido. Ogni amminoacil-tRNA-sintetasi è capace di riconoscere specificamente sia l'amminoacido sia il corrispondente tRNA e catalizza poi la formazione di un legame esterico ad alta energia tra il gruppo carbossilico dell'amminoacido e il gruppo ossidrilico 2′ o 3′ dell'adenosina, che costituisce l'estremità 3′ del tRNA. Questa energia di legame è molto importante perché verrà utilizzata successivamente per la formazione del legame peptidico nel corso della sintesi proteica; essa è derivata dall'idrolisi di una molecola di ATP al momento dell'attivazione dell'amminoacido da parte dell'amminoacil-tRNA-sintetasi stessa. Questa doppia reazione è molto complessa anche perché è essenziale, per l'accuratezza della sintesi delle proteine, che ogni tRNA sia caricato correttamente con l'amminoacido corrispondente.
mRNA
Nel loro fondamentale lavoro del 1961 sulla regolazione dell'operone lattosio, François Jacob e Jacques Monod esclusero, sulla base di dati sperimentali, che l'rRNA (l'RNA strutturale dei ribosomi) con la sua grande stabilità metabolica potesse svolgere il ruolo di portatore dell'informazione per la sintesi delle proteine e ipotizzarono, quindi, l'esistenza di una distinta classe di molecole di RNA metabolicamente instabili, che chiamarono 'RNA messaggero', la cui vita media molto breve permettesse alla cellula di rispondere rapidamente ai cambiamenti ambientali adattando la produzione di proteine alle esigenze del momento. Così, delle tre classi di RNA coinvolte nella sintesi proteica, l'mRNA è quello che è stato scoperto per ultimo, anche perché più difficile da isolare e analizzare rispetto agli altri due componenti, rRNA e tRNA. Infatti, l'mRNA rappresenta quantitativamente una bassa percentuale degli RNA cellulari (2÷5% rispetto all'80% di RNA ribosomale e al 15% di tRNA).
Tutti gli mRNA di tutte le cellule procariotiche ed eucariotiche hanno almeno una regione codificante, cioè una serie di triplette di nucleotidi (codoni) che determinano l'ordine degli amminoacidi nella proteina sintetizzata seguendo le regole di corrispondenza codone/amminoacido del codice genetico. Inoltre, negli mRNA sono presenti anche regioni non codificanti (UTR, Untranslated region) che si trovano all'inizio (estremità 5′) e alla fine (estremità 3′) della molecola, e in alcuni casi anche all'interno della sequenza. Gli mRNA procariotici possono essere policistronici, cioè possono essere il prodotto della trascrizione di più geni adiacenti nel genoma (operoni) e codificare quindi per più proteine. In tal caso questi mRNA contengono, oltre a una 5′UTR all'estremità 5′ e una 3′UTR all'estremità 3′, anche una o più regioni non codificanti intergeniche (usualmente piuttosto corte, al massimo di qualche decina di nucleotidi), che separano le regioni che codificano per le varie proteine. Gli mRNA eucariotici sono invece quasi sempre monocistronici, cioè ogni mRNA codifica per una sola proteina essendo costituito da una 5′UTR seguita dalla regione codificante e poi da una 3′UTR. Un'altra caratteristica degli mRNA eucariotici è costituita dalla presenza di modificazioni delle due estremità 5′ e 3′, modificazioni che avvengono nel nucleo e che rientrano nei processi di maturazione degli mRNA, prima che questi vengano trasportati nel citoplasma. In particolare, l'estremità 5′ è protetta da una struttura chiamata 5′Cap (cappuccio), formata da una base insolita (m7G, cioé Guanina metilata in posizione 7) unita, con un particolare legame fosfodiesterico 5′-5′ trifosfato, al primo nucleotide dell'mRNA. L'estremità 3′ degli mRNA eucariotici è estesa da una coda di poli(A), cioè una sequenza di circa duecento adenine che vengono aggiunte da uno specifico complesso enzimatico al momento della terminazione della trascrizione. Ambedue queste modificazioni, 5′Cap e poli(A) al 3′, non soltanto proteggono le estremità degli mRNA da attacchi esonucleolitici, ma possono anche svolgere un ruolo.
Fasi della Sintesi Proteica
Anche la traduzione, come la trascrizione, avviene nelle tre fasi di inizio, allungamento e terminazione.
Inizio
Nella fase di inizio la subunità minore del ribosoma si lega al proprio sito di rocnoscimento sul filamento di mRNA. Quindi un tRNA caricato con l'amminoacido metionina si lega al codone di inizio AUG (il primo amminoacido di una catena polipeptidica è per questo sempre la metionina, anche se non tutte le proteine mature portano questo amminoacido come N-terminale, dato che spesso viene rimosso da un enzima) formando il complesso di inizio al quale si aggiunge la subunità ribosomiale maggiore portando il tRNA ad occupare il sito C.
Ricordiamo che una molecola di tRNA lega solo uno specifico aminoacido, che è in grado di identificare sull’mRNA la tripletta corrispondente. La parte di mRNA che contiene la tripletta è detta codone; a questo si lega una molecola di tRNA con un’altra sequenza di tre basi, detta anticodone. L’mRNA si lega ai ribosomi, precisamente con la subunità minore, e quando si hanno dei fattori di inizio sempre di natura proteica, a questo complesso si aggiunge la subunità maggiore. Il primo amminoacido è sempre la metionina (Formilmetionina nei procarioti) perché la sua tripletta dà un segnale di inizio alla sintesi. Il tRNA che la trasporta occupa sempre il sito P della subunità maggiore; si lega con il suo codone al primo codone dell’mRNA. Questa reazione richiede energia sotto forma di GTP.
Allungamento
Nella fase di allungamento un'altro tRNA carico si lega al codone esposto nel sito A. Il nuovo amminoacido si lega, con un legame peptidico, al primo amminoacido (metionina) grazie all'attività peptidil-transferasica della subunità maggiore. Quando il ribosoma si sposta di un codone lungo l'mRNA, il tRNA libero si ritrova nel sito D dove viene rilasciato, mentre il peptide in via di sintesi viene a trovarsi nel sito C. Il processo si ripete in continuazione portando la catena polipeptidica ad allungarsi sempre di più e con la partecipazione di proteine dette fattori di allungamento.
In questa fase, grazie ad un fattore di allungamento, un altro tRNA, carico del suo amminoacido, che corrisponde al secondo codone dell’mRNA, occupa il sito che in precedenza era vuoto. Adesso grazie ad un enzima, il peptidil transferasi, si forma un nuovo legame: è un legame peptidico tra il gruppo carbossilico del primo amminoacido e il gruppo amminico del secondo. A questo punto troviamo due aminoacidi legati e una molecola di tRNA senza amminoacido. Quest’ultima lascia il sito P mentre il dipeptide (ossia due amminoacidi con un legame peptidico) si sposta dal sito A al sito P mediante il secondo tRNA. Per permettere la sintesi anche l’mRNA si sposta, sempre nella subunità minore, di tre nucleotidi. IN questo modo il sito A è esposto ad un nuovo codone.
Terminazione
La catena è ormai completa quando il sito A raggiunge uno dei tre codoni di stop: UAA, UAG, UGA. Qui un fattore si rilascio si lega al complesso e stacca il polipeptide dal tRNA nel sito C consentendo una reazione di idrolisi. Infine tutte le restanti componenti, mRNA e subunità ribosomiali, si separano.
La sintesi delle proteine finisce quando il sito A viene esposto ad una tripletta di fine (UAA, UGA, UAG). Una molecola di mRNA può essere letta da più di un ribosoma nello stesso tempo.
La traduzione è il processo secondo cui l’mRNA è tradotto in una catena polipeptidica. Tale processo avviene nei ribosomi. La subunità minore lega l’mRNA; la subunità maggiore presenta due siti, chiamati A e P, che accolgono due molecole di tRNA. Nel sito P si trova la catena polipeptidica (La sequenza di amminoacidi) che si sta formando, ed è legata all’ultimo tRNA, mentre nel sito A ci sono i tRNA carichi del rispettivo amminoacido.
Sintesi Proteica - Punti chiave
- La trascrizione descrive la sintesi del pre-mRNA a partire dal filamento modello di DNA. Questo viene sottoposto a splicing dell'mRNA (negli eucarioti) per produrre una molecola di mRNA composta da esoni. Gli enzimi DNA elicasi e RNA polimerasi sono i principali responsabili della trascrizione.
- La traduzione è il processo con cui i ribosomi "leggono" l'mRNA, utilizzando il tRNA. È qui che viene creata la catena polipeptidica. Il principale motore enzimatico della traduzione è la peptidil transferasi.
- La catena polipeptidica può subire ulteriori modifiche, come il ripiegamento e l'aggiunta del corpo di Golgi.
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