La biologia molecolare è una branca recente della biologia che studia la struttura e le funzioni del DNA (acido desossiribonucleico), la sua trascrizione in RNA (acido ribonucleico) e la successiva formazione di proteine. Alla base vi sono le proprietà della doppia elica del DNA, che è formato da unità ripetitive e complementari, composte da solo 4 basi azotate diverse (adenina, guanina, timina e citosina). Queste quattro basi azotate costituiscono le lettere con cui il codice genetico è scritto.
Il codice genetico consente che il materiale genetico contenuto nelle cellule venga tradotto nelle proteine necessarie al suo funzionamento. Il primo passo in quella che è la traduzione del materiale genetico in proteine è rappresentato dalla trascrizione del DNA. Senza addentrarci nei complessi meccanismi alla base di questo processo, ci limiteremo a dire che, grazie all'intervento di uno specifico enzima chiamato RNA polimerasi, il doppio filamento di DNA viene separato e uno dei filamenti risultanti viene trascritto al fine di produrne uno stampo complementare (non una copia esatta) in forma di RNA.
Al centro di questo processo che costituisce il cuore dell’esistenza stessa, abbiamo il DNA, che nasconde i segreti dell’ereditarietà custodendone il codice genetico.
Il Codice Genetico e la Sintesi Proteica
Il gene è un tratto di DNA che contiene le informazioni per la produzione di proteine. La sequenza delle basi azotate rende specifica l’informazione genetica di ogni organismo in quanto costruisce una proteina codificando un linguaggio particolare.
Ciascun codone è in grado di codificare per - o, in termini più semplici, rappresenta - un singolo amminoacido. Gli amminoacidi costituiscono, invece, le lettere con cui vengono scritte le proteine: dalla combinazione di diversi amminoacidi si generano differenti proteine. 61 codoni codificano per amminoacidi: fra i 20 amminoacidi di cui sopra, alcuni possono essere codificati da codoni diversi, mentre altri possiedono un unico codone che è in grado di codificarli (in particolare, metionina e triptofano).
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Come si può vedere dall'immagine, il codone AUG (Adenina-Uracile-Guanina) codifica per l'amminoacido metionina ed è anche il codone di avvio. Ossia, si tratta del codone di inizio che stabilisce il cosiddetto frame di lettura del codice genetico: dopo il codone AUG, il successivo gruppo di tre basi azotate viene letto come secondo codone, il gruppo successivo come terzo codone e così via.
Tuttavia, esistono delle eccezioni: la sintesi proteica che avviene a livello dei mitocondri (organelli cellulari dotati di proprio DNA implicati nella funzione energetica della cellula) utilizza, infatti, un codice genetico differente. Il codice genetico è universale: ciò significa che tutti gli organismi viventi conosciuti utilizzano il medesimo codice genetico. Il codice genetico è inequivocabile e non ambiguo, ossia ogni codone codifica solo ed esclusivamente per un amminoacido, oppure rappresenta un codone di stop.
RNA: Il Messaggero del DNA
Cos’è l’RNA o acido ribonucleico? Si tratta di una macromolecola che svolge una funzione fondamentale nel processo di formazione delle proteine a partire dal DNA, e per gli esseri umani le proteine sono indispensabili per la sopravvivenza. Sono loro, infatti, a garantire il buon sviluppo e il corretto funzionamento delle cellule.
Per RNA si intende una macromolecola biologica, costituita da più catene o filamenti di molecole più piccole. Queste molecole più piccole prendono il nome di monomeri. Nel caso dell’RNA i monomeri hanno un proprio nome specifico: nucleotidi. La lunghezza dei filamenti di RNA è variabile e può andare cioè da alcune centinaia ad alcune migliaia di nucletodi. L’elemento centrale dei nucleotidi è il pentoso, a cui si legano il gruppo fosfato e la base azotata.
Sul DNA si trovano tutte le informazioni per produrre le proteine. Il tratto di DNA responsabile della produzione delle proteine si chiama gene. C’è, però, un problema. Il DNA è protetto all’interno del nucleo cellulare. Questo significa che non può trasportare all’esterno le informazioni. A questo punto la risposta alla domanda “cos’è l’RNA?” comincia a diventare più chiara. É la macromolecola che copia le informazioni del DNA e le trasporta fuori dal nucleo per consentire la produzione delle proteine. Durante la trascrizione alcuni enzimi svolgono l’elica del DNA per consentire l’accesso al polimerasi.
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Tipi di RNA
- L’m-RNA è fondamentale per la formazione delle proteine. Trasporta, infatti, le informazioni genetiche, codificate nel DNA, dal nucleo al citoplasma. Questo significa che viene sintetizzato nel nucleo durante il processo di trascrizione. Ma come avviene questo passaggio?
- Infine, il t-RNA è una molecola relativamente piccola. Il ruolo del t-RNA consiste nel trasferire ai ribosomi i vari amminoacidi.
Differenze tra DNA e RNA
Entrambi sono acidi nucleici e si tratta di un biopolimero costituito da due filamenti di nucleotidi. I due filamenti sono orientati in direzioni opposte. La prima differenza è quindi nella struttura. La seconda differenza è nello zucchero. Quello del DNA è il desossiribosio, mentre quello dell’RNA è il ribosio. Cosa cambia? Nel desossiribosio è presente un ossigeno in meno.
La terza differenza riguarda le basi azotate. Quanti basi azotate ha l’RNA? Il DNA ha sempre 4 basi azotate, ma una è diversa. Contiene adenina, guanina, citosina e timina. Non cambia molto perché la timina si appaia con l’adenina nel DNA, mentre l’uracile si appaia con l’adenina nell’RNA.
| Caratteristica | DNA | RNA |
|---|---|---|
| Struttura | Doppia elica | Singolo filamento |
| Zucchero | Desossiribosio | Ribosio |
| Basi azotate | Adenina, Guanina, Citosina, Timina | Adenina, Guanina, Citosina, Uracile |
Il Processo di Sintesi Proteica
Il passaggio dal gene, l’unità funzionale del DNA, alla proteina avviene in due fasi: la trascrizione del DNA genera l’RNA, la traduzione dell’RNA porta alla sintesi della proteina. Possiamo immaginare il DNA come il manuale di istruzioni della cellula. Questo manuale è diviso in capitoli, i geni.
È stato stimato che il genoma umano (l’insieme dei geni presenti nel DNA delle cellule umane) contenga circa 20.000 sequenze che forniscono alla cellula le istruzioni per sintetizzare proteine (in gergo si dice che “codificano una proteina”). La porzione di DNA non codificante è enorme e il suo ruolo non è ancora ben compreso. Si ipotizza che buona parte di questo abbia funzioni regolatorie ed è noto che i telomeri, porzioni di DNA non codificante poste alla fine dei cromosomi, servono a proteggere il DNA.
Non tutte le proteine vengono sintetizzate in ogni cellula e/o in ogni momento. Il primo passaggio nella sintesi di una proteina consiste nella trascrizione del DNA, che possiamo considerare come un “ordine di produzione”. In questo processo, la sequenza del gene viene copiata mediante la sintesi di una molecola di acido ribonucleico (in inglese RiboNucleic Acid, da cui l’abbreviazione RNA).
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Come il DNA, l’RNA è costituito da nucleoidi contenenti un gruppo fosfato, uno zucchero (il ribosio) e una base azotata (adenina, citosina, guanina e uracile [U], questo ultimo in sostituzione della timina presente nel DNA). Similmente a quanto avviene nella duplicazione, un filamento di DNA funge da stampo per la sintesi del nuovo acido nucleico: il filamento di RNA è quindi complementare al filamento di DNA. L’enzima chiave della trascrizione è l’RNA polimerasi.
Questo enzima, assieme a proteine accessorie, si lega al DNA in corrispondenza di una zona a monte del gene che deve essere trascritto, chiamata promotore. Sequenze chiamate enhancer controllano l’attivazione della trascrizione. Man mano che la doppia elica di DNA si svolge, l’RNA polimerasi aggiunge nucleotidi al filamento di RNA; la sintesi avviene in direzione 5’-3’.
Nelle cellule umane esistono tre tipi di RNA polimerasi: l’RNA polimerasi II sintetizza l’RNA messaggero (mRNA) che codifica la sequenza della proteina, mentre l’RNA polimerasi I e III sintetizzano l’RNA ribosomiale (rRNA) e l’RNA trasfer (tRNA) coinvolti nel processo di traduzione. Una sequenza di stop segnala alla polimerasi quando interrompere la sintesi dell’RNA.
L’RNA messaggero subisce poi un processo di maturazione, in cui vengono eliminate alcune sequenze intercalanti (introni) e mantenute solo le sequenze codificanti (esoni); l’RNA maturo è perciò più corto di quello appena sintetizzato (pre-mRNA). Grazie al processo di splicing,da un singolo trascritto possono essere generati più mRNA maturi che codificano forme alternative di una stessa proteina.
Quando la cellula è in possesso dell’ordine di produzione (mRNA), può inviarlo alle fabbriche delle proteine, i ribosomi. È in questi organelli, costituiti da proteine e rRNA e localizzati nel citoplasma, che avviene l’assemblaggio della proteina. Il processo di traduzione dell’RNA si basa sull’esistenza di un codice genetico che mette in relazione la sequenza del DNA con la sequenza degli amminoacidi, le unità base delle proteine. Esistono 20 tipi di amminoacidi (leucina, glicina, metionina…). Una sequenza di tre nucleotidi è detta codone e codifica l’informazione per un singolo amminoacido.
Il codice è ridondante: più codoni possono codificare per lo stesso amminoacido. Un esempio per chiarire: sia il codone AAA che il codone AAG codificano per la lisina, ma sia il codone AAA sia il codone AAG codificano solo per la lisina. Esistono 3 codoni di stop, che segnalano la fine della sequenza codificante. Gli amminoacidi arrivano nel ribosoma trasportati dai tRNA. Una porzione del tRNA (anticodone) si appaia al codone corrispondente e permette che sia il corretto amminoacido a legarsi alla catena di amminoacidi nascente. Mutazioni nella sequenza nucleotidica portano a mutazioni nella sequenza amminoacidica della proteina.
I ribosomi sono costituiti da due subunità: una maggiore (chiamata subunità 60S) e una minore (chiamata subunità 40S). In tutto questo procedimento entra in gioco il l'RNA di trasporto (tRNA). Esso si caratterizza per una classica forma a trifoglio, conferitagli dai legami idrogeno che si instaurano fra le basi azotate che lo compongono.
Il tRNA non codifica per alcuna proteina ma è fondamentale nella sintesi proteica; esso, infatti, trasporta un amminoacido e presenta nella sua struttura un gruppo di tre nucleotidi - definito anticodone - che riconosce ed interagisce con un codone corrispondente sull'mRNA. Alcuni tRNA si legano ad un solo codone, mentre altri possono riconoscere più di un codone.
Man mano che la lettura dell'mRNA e l'appaiamento anticodone-codone procedono, gli amminoacidi vengono rilasciati dal tRNA e, fra di essi, si formano legami peptidici ad opera dell'enzima peptidil transferasi.
TRADUZIONE dell’informazione trascritta che si basa sul codice genetico. Il tRNA si carica di un amminoacido, si associa alle molecole di mRNA e interagisce con i ribosomi. Una volta create le catene polipeptidiche possono dirigersi verso un organulo o verso il reticolo endoplasmatico. La maggior parte delle proteine create devono essere modificate dopo la traduzione per poter diventare proteine funzionali.
La duplicazione del DNA e le mutazioni durante la divisione cellulare, la cellula madre costruisce una copia esatta del proprio DNA per trasferire l’intero patrimonio genetico necessario per le funzioni che deve svolgere e per la sopravvivenza. Le istruzioni di duplicazione sono contenute nel DNA stesso.
Applicazioni della Biologia Molecolare
La progressiva evoluzione biotecnologica ha consentito di sequenziare il DNA, conoscendone così la normale composizione e facilitando l’individuazione di mutazioni associate a numerosissime patologie. Le metodiche più utilizzate in biologia molecolare sono quelle della PCR (polymerase chian reaction), che permettono di amplificare piccoli tratti di DNA ed individuare alterazioni geniche anche con la presenza di poche cellule.
Le indicazioni della biologia molecolare in oncoematologia sono molteplici. Dal punto di vista diagnostico le tecniche di biologia molecolare sono divenute di complemento alle tecniche di morfologia, immunologia e citogenetica. Le malattie nelle quali si applica di routine sono le leucemie acute, la leucemia mieloide cronica e le malattie linfoproliferative croniche, anche se metodiche di biologica molecolare si stanno espandendo ormai in tutte le patologie oncoematologiche.
La biologia molecolare in ematologia ha numerosissime implicazioni cliniche:
- Permette di confermare la diagnosi di patologie specifiche. Ad esempio, il riscontro di mutazione di JAK2 nella policitemia vera, di JAK2, CALR o MPL nella trombocitemia essenziale, di BCR-ABL1 nella leucemia mieloide cronica o di PLM-RARα nella leucemia acuta promielocitica.
- Consente di definire differenti sottotipi di leucemia acuta, con caratteristiche cliniche specifiche, prognosi e risposta alle terapie distinte. Ad esempio, è essenziale la ricerca della mutazione di NPM1 nella leucemia acuta mieloide, in quanto caratterizza un'entità con prognosi piuttosto favorevole e sensibilità maggiore a certi farmaci.
- Permette di riconoscere lesioni molecolari che possono essere il target (bersaglio) per indirizzare terapie mirate. Un esempio è la mutazione di FLT3 nella leucemia acuta mieloide, che può essere colpita da terapie a bersaglio molecolare (inibitori di FLT3), o di BCR-ABL nella leucemia acuta linfoide Philadelphia - pos.
- È utile nella valutazione della risposta alla terapia, con tecniche diverse a seconda delle patologie. Attraverso il monitoraggio della malattia minima residua consente infatti di valutare precisamente la sensibilità al trattamento e di individuare precocemente possibili recidive. Ciò è particolarmente rilevante nelle leucemie acute e nella leucemia mieloide cronica, ove è consolidata nella pratica clinica, ma è oggi sempre più utilizzata anche in patologie come mieloma e linfomi.
L’avvento di moderne tecniche di sequenziamento, veloci e relativamente poco costose, ma che consentono di valutare le mutazioni in moltissimi geni contemporaneamente, come il NGS (next generation sequencing), sta rivoluzionando il panorama della diagnostica mmolecolare. Già oggi, l’analisi in NGS può essere utilizzata nelle leucemie acute mieloidi per classificarle e decidere l’eventuale indicazione al trapianto allogenico di cellule staminali.
Anche nelle neoplasie mieloproliferative croniche e nelle sindromi mielodisplastiche lo studio in NGS può essere effettuato in molti casi per poter applicare nuovi score prognostici, potenzialmente utili per guidare anche la scelta di terapie oppure, nella leucemia mieloide cronica, per identificare la presenza di mutazioni di BCR/ABL ( responsabili della resistenza al trattamento in corso) e quindi indicazioni ad eventuali modifiche del farmaco. Inoltre, l’uso di tale metodica si sta espandendo in molte altre patologie e potrebbe diventare anche utile nel monitoraggio della malattia minima residua.