L’epcidina è un piccolo peptide epatico che regola l’omeostasi sistemica del ferro. Rappresenta l’ormone chiave del metabolismo marziale, identificato nel 2001 da tre gruppi attraverso approcci diversi in modelli murini e nelle urine di volontari sani.
L’epcidina circolante è prodotta dagli epatociti a partire da un precursore di 84 aminoacidi (pro-epcidina) per l’azione di proteasi che danno luogo ad un peptide maturo di 25 aminoacidi. La presenza di 8 cisteine determina la formazione di 4 ponti disolfuro, e il conseguente ripiegamento della molecola su sé stessa a formare una struttura a forcina (Ganz T, 2011). Tale struttura la rende, di fatto, analoga alle defensine, ovvero alla famiglia di peptidi ad attività antimicrobica dell’immunità innata o naturale.
Mutazioni di epcidina nell’uomo sono estremamente rare e causano sovraccarico di ferro precoce e grave (emocromatosi giovanile) (Roetto A et al, 2003). L’identificazione di epcidina ha rivoluzionato la fisiopatologia dei disordini del metabolismo del ferro e permesso di reinterpretare i disordini genetici da sovraccarico e carenza di ferro.
Regolazione dell'Epcidina
La regolazione dell’epcidina è quindi fondamentale per assicurare ferro alle cellule, in particolare ai precursori eritroidi, ma anche per evitarne pericolosi eccessi. Per questa ragione l’epcidina è sottoposta ad una complessa serie di controlli da parte di attivatori e inibitori.
Attivazione dell'epcidina
La sintesi di epcidina è stimolata da ferro e citochine infiammatorie. L’attivazione dell’epcidina nell’epatocita è mediata dal sistema delle bone morphogenetic proteins (BMP), in particolare BMP2 e BMP6: la prima attiva epcidina in condizioni basali, mentre la seconda ne incrementa la produzione in relazione all’aumento del ferro. Il legame del ligando BMP ai recettori (BMPR) fosforila le SMAD attivatorie 1/5/8 che, in complesso con SMAD 4, traslocano dal citosol al nucleo per attivare i geni che presentano elementi BMP-responsivi nel loro promotore, geni di cui l’epcidina è un classico esempio.
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BMP6 e BMP2, citochine prodotte dalle cellule endoteliali dei sinusoidi epatici, regolano la sintesi di epcidina, in quanto la loro inattivazione germinale nel topo causa grave e precoce sovraccarico di ferro (Meynard D et al, 2009; Andriopoulos B Jr et al, 2009; Koch PS et al, 2017). In presenza del corecettore hemojuvelin (HJV) le BMP si legano ai recettori (BMPRI e II) attivando la trasmissione del segnale mediante fosforilazione (P) delle proteine SMAD. Il complesso SMAD attivato migra nel nucleo dove si lega a sequenze specifiche del promotore di epcidina (HAMP).
BMP2 è coinvolta nell’attivazione di epcidina, in quanto topi con inattivazione di Bmp2 nelle cellule endoteliali sviluppano sovraccarico di ferro a bassa epcidina (Koch PS et al, 2017), con effetto indipendente da BMP6 (Canali S, Wang CY et al, 2017b). A differenza di BMP6, BMP2 non appare regolata da ferro e la sua espressione è costante e piuttosto elevata. Il modello attuale prevede quindi che BMP6 risponda soprattutto all’aumento del ferro tissutale (epatico), mentre BMP2 potrebbe controllare la produzione basale di epcidina (Canali S, Zumbrennen-Bullough KB et al, 2017a).
La sintesi di epcidina è stimolata anche dall’infiammazione, soprattutto dai lipopolisaccaridi (LPS) e dall’interleuchina 6 (IL-6). Quest’ultima, legandosi al suo recettore (IL-6R) attiva JAK2 che trasmette il segnale attraverso STAT3 (Verga Falzacappa MV et al, 2007). L’epcidina è anche attivata da citochine infiammatorie, la principale delle quali è IL-6, per ridurre il ferro circolante e sequestrarlo nei macrofagi. Tale azione ha a che fare con l’attività anti-batterica dell’epcidina, che è strutturalmente correlata alle defensine, cioè piccoli peptidi dell’immunità innata ad attività anti-batterica diretta.
La via di segnale BMP-SMAD si attiva quando aumenta il ferro circolante, che legandosi alla transferrina (TF) forma transferrina diferrica. La TF-diferrica è molto affine a TFR1 che lega per iniziare il ciclo endosomico e favorire l’uptake cellulare del ferro. La TF-diferrica lega, anche se con minore affinità, TFR2, a sua volta in complesso con la proteina dell’emocromatosi HFE, per attivare il segnale, mediato dal legame di BMP2 ai recettori. Il segnale si spegne quando, in seguito all’aumento dell’epcidina, si riduce il ferro circolante e quindi la TF-diferrica. Una risposta più intensa e protratta nel tempo si ha quando aumenta il ferro dei depositi epatici: le cellule endotelio-sinusoidali epatiche “sentono” l’Incremento di ferro degli epatociti e producono BMP6, che è in grado di potenziare il segnale e la trascrizione di epcidina. Questa risposta persiste sino a che il ferro di deposito non viene riportato a valori normali. In questo processo di attivazione è essenziale la presenza dell’“emogiuvelina” (hemojuvelin), codificata dal gene responsabile della emocromatosi giovanile (HJV), che si composta come un co-recettore per le BMP, mentre TFR2 (e HFE) segnalano al pathway BMP-SMAD la concentrazione di ferro circolante.
Inibizione dell'Epcidina
Nella sideropenia l’attività BMP è soppressa da uno specifico inibitore epatico, la serin-proteasi matriptasi 2, codificata dal gene TMPRSS6 sul cromosoma 22. Matriptasi-2 è una proteasi transmembrana che inibisce epcidina attraverso il blocco di componenti del complesso di attivazione (Enn C et al, 2020) e soprattutto il clivaggio di hemojuvelin, la proteina co-recettore delle BMP sulla membrana degli epatociti, spegnendo in tal modo il principale segnale attivante.
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Il gene è stato clonato nel topo “Mask” in cui matriptasi-2 è inattiva per una delezione del dominio catalitico serin-protesico (Du X et al, 2008). Il topo knock out per Tmprss6 (Folgueras AR et al, 2008) ha un fenotipo sovrapponibile a Mask: entrambi sono piccoli, senza pelo del tronco ed hanno un’anemia sideropenica resistente alla somministrazione di ferro dovuta a eccessiva produzione di epcidina.
L’epcidina è tipicamente ridotta anche nelle condizioni di ipossia (es. ad alta quota), per permettere un maggior assorbimento di ferro con la finalità di aumentare la produzione di globuli rossi (Piperno A et al, 2011), così come dopo un’emorragia per consentire la ricostituzione del patrimonio eritroide. E’ anche ridotta nelle cosiddette anemie “iron loading” quali la b-talassemia non-trasfusione-dipendente (NTDT), laddove il segnale positivo per l’assorbimento del ferro prevale sul segnale inibitorio dei depositi di ferro.
Il principale regolatore eritroide di epcidina è l’eritroferrone (ERFE), una proteina prodotta dagli eritroblasti midollari (murini ed umani) quando stimolati da eritropoietina (Kautz L et al, 2014). Si tratta di un ormone membro della famiglia C1q/TNF espresso da diversi tessuti, la cui espressione è incrementata dopo stimolo eritropoietinico solo nei tessuti emopoietici.
Nel modello murino l’espressione di ERFE aumenta poche ore dopo la somministrazione di EPO o dopo salasso, prima della soppressione di epcidina, che avviene dopo 12-15 ore. Tale meccanismo non si verifica nel topo knock out per Erfe, che presenta solo una lieve e precoce flessione dell’espressione di epcidina. ERFE agirebbe sequestrando BMP6 e BMP2 nello spazio extracellulare, impedendone il legame con i complessi recettoriali di membrana e il conseguente pathway di attivazione (Wang CY et al, 2020).
Un altro inibitore di epcidina documentato in vivo è PDGF-BB prodotto dalle piastrine e altre cellule durante ipossia (Sonnweber T et al, 2014). Anche ormoni e farmaci possono inibire la produzione di epcidina. Tra gli ormoni il testosterone mantiene i livelli di epcidina più bassi nell’uomo rispetto alla donna per favorire l’eritropoiesi molto più espansa (Latour C et al, 2014). Tra i farmaci, gli immunosoppressori che legano FKBP12 (rapamicina e tacrolimus) attivano epcidina tramite lo spiazzamento della immunofillina dal recettore delle BMP (ALK2) target di BMP6 (Colucci S et al, 2017) per evitare l’attivazione della via BMP6 quando il ferro non è elevato.
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Infine, l’epcidina può essere soppressa con meccanismo epigenetico, sia in condizioni di carenza di ferro che nella espansione eritropoietica da stimolo eritropoietinico (Pascricha SR et al, 2017).
Come è importante attivare l’epcidina per riportare il ferro a valori normali e evitarne l’eccesso, così l’epcidina deve essere soppressa quando il ferro disponibile non è sufficiente per l’eritropoiesi ed è necessario incrementane l’assorbimento. La serin-proteasi matriptasi 2, prodotta dale gene TMPRSS6 ed espressa sulla membrana degli epatociti, è il mediatore principale che sopprime il livello basale di produzione di epcidina nella sideropenia e in condizioni di ipossia. Mutazioni di TMPRSS6 causano una forma genetica a trasmissione recessiva di anemia sideropenica refrattaria al ferro, (iron refractory iron deficiency anemia o IRIDA) sia nel modello animale che nell’uomo. Nonostante diverse ipotesi siano state avanzate sulla funzione di TMPRSS6 (Enns CA et al, 2023), l’inattivazione di hemojuvelin dalla superficie dell’epatocita è considerato il meccanismo principale in quanto spegne il segnale BMP-SMAD in modo rapido e duraturo (Silvestri L et al, 2008).
Nell’anemia, o meglio nella conseguente risposta eritropoietinica, l’ormone eritroferrone (ERFE) riduce la sintesi di epcidina per assicurare un adeguato rifornimento di ferro al midollo per la produzione di globuli rossi. ERFE è secreto dai precursori eritroidi e sequestra le BMP nello spazio epatico peri-sinusoidale per prevenire l’attivazione della cascata di segnale e la produzione di epcidina. (Arezes J et al, 2018). La delezione di Erfe nel topo non da luogo ad anemia né ad un particolare fenotipo ematologico e il recupero dopo emorragia avviene regolarmente. Nel topo talassemico la delezione di Erfe corregge il sovraccarico di ferro, ma l’epcidina rispetto al contenuto di ferro epatico è inappropriatamente ridotta.
Da tempo alla ricerca di un altro fattore con una funzione simile ad ERFE, il gruppo di Leon Kautz ha finalmente identificato l’epatochina fibrinogen-like protein 1 (FGL1) come ulteriore potente soppressore di epcidina (Sardo U et al, 2024). FGL1 è indotto nel fegato in risposta all’ipossia durante la ripresa dall’anemia dopo emorragia. La sua produzione è elevata anche nel topo talassemico. Tuttavia, la produzione di FGL1 appare indipendente dall’eritropoietina. Il fattore è stato identificato nel topo knock-out per Erfe sottoposto a salassi, esaminando i trascritti predetti codificare proteine secrete nel midollo e nel fegato. FGL1 è una proteina di fase acuta con un ruolo segnalato in precedenza nel metabolismo e nel cancro. E’ stimolato dall’ipossia tramite HIF2-a. L’attività inibitoria nei confronti dell’epcidina dipende dal fatto che FGL1 lega direttamente BMP6, inibendo la canonica trasmissione del segnale. FGL1 sembra essere importante nella soppressione cronica dell’epcidina. Nel modello sperimentale utilizzato da Kautz e collaboratori, FGL1 interviene in seconda battuta rispetto ad ERFE (Figura I) (Silvestri L et al, 2024).
La delezione di Fgl1 nel topo non comporta alcun fenotipo ematologico. Le uniche anormalità sono un aumento del peso corporeo e una ridotta tolleranza glicidica. Inoltre, i livelli di epcidina sono più elevati sia in condizioni basali che dopo emorragia. I dati suggeriscono pertanto che FGL1 abbia sicuramente un ruolo di compenso nell’anemia e nell’ipossia, in modalità eritropoietina-indipendente a differenza di ERFE. Saranno necessari studi ulteriori per chiarire il suo ruolo in malattie ematologiche come la talassemia, dove il sovraccarico di ferro è attualmente attribuito all’eccesso cronico di ERFE, ma dove coesistono livelli elevati di FGL1.
Meccanismo d'azione dell'epcidina
L’epcidina inibisce il rilascio di ferro dalla cellula alla transferrina circolante legandosi alla proteina transmembrana ferroportina, determinandone l’internalizzazione e la degradazione lisosomiale (Nemeth E et al, 2004). L’effetto principale di epcidina è un blocco fisico del canale di ferroportina attraverso cui il ferro viene esportato (Aschemever S et al, 2018). Successivamente l’epcidina induce la degradazione selettiva della ferroportina contenente ferro, come recentemente dimostrato mediante microscopia elettronica criogenica (Billesbolle CB et al, 2020).
La regolazione di ferroportina è complessa: la sua trascrizione è aumentata dall’eme e soppressa dall’infiammazione. E’ anche regolata post-trascrizionalmente dalle iron regulatory proteins (IRPs), in quanto l’mRNA di ferroportina possiede un elemento IRE (Iron Responsive Element) nella regione 5’UTR.
Nel duodeno il ferro attraversa la membrana baso-laterale per essere ceduto alla transferrina ad opera di ferroportina con la cooperazione dell’ossidasi efestina. Ferroportina è altamente espressa anche nella serie eritroide e nei globuli rossi maturi dove esporta attivamente il ferro. Nel globulo rosso, ferroportina è esclusivamente regolata da epcidina e, in carenza di ferro, non essendo degradata da epcidina, continua ad esportare ferro nella circolazione. Tale esportazione contribuirebbe a circa il 20% del ferro circolante (Zhang DL et al, 2018a; Zhang DL et al, 2018b). Al contrario, nel sovraccarico di ferro il rilascio del ferro alla circolazione viene bloccato dagli alti livelli di epcidina.
Gli Autori hanno confermato l’importanza della ferroportina eritrocitaria inattivandola in modo specifico nella linea eritroide del topo, e dimostrando che i globuli rossi sono precocemente distrutti per danno ossidativo, con conseguente anemia emolitica.
Ruolo dell'epcidina in altri tessuti
Il cuore è l’organo che dopo il fegato esprime epcidina in quantità maggiormente elevate, sebbene 30 volte inferiori rispetto all’espressione epatica. L’inattivazione specifica dell’epcidina cardiaca nel topo non altera il metabolismo sistemico del ferro ma induce un grave sovraccarico di ferro dei cardiomiociti con scompenso cardiaco. L’espressione di epcidina cardiaca è stimolata da carenza di ferro, ipossia, infiammazione e l’effetto è limitato alla degradazione di ferroportina cardiaca.
Recentemente è stato documentato un ruolo per epcidina prodotta dalle cellule dendritiche dell’intestino. Qui l’epcidina appare essenziale per permettere la riparazione della mucosa in modelli sperimentali di danno intestinale, un fenomeno indipendente dall’epcidina epatica e dall’entità dei livelli di ferro (Bessman NJ et al, 2020).
Epcidina e attività antimicrobica
L’attività di epcidina come peptide antimicrobico è ben documentata in vitro. Il ferro è infatti un elemento essenziale non solo per il nostro organismo, ma anche per la maggior parte dei microrganismi patogeni. Durante un’infezione, si sviluppa pertanto una sorta di competizione per l’elemento tra l’ospite e i germi patogeni invadenti. Questi ultimi utilizzano vari sistemi cosiddetti “siderofori” (Kramer J et al, 2020) per procurarselo a spese dell’ospite, mentre l’epcidina agisce al contrario sottraendo il metallo dalla circolazione per renderlo indisponibile ai germi stessi.
Nel modello murino l’effetto dell’epcidina è quello di eliminare dalla circolazione l’NTBI che è la specie di ferro più facilmente acquisibile da alcuni tipi di patogeni. Inoltre, l’epcidina funziona da peptide antimicrobico anche in infezioni gravi quali le sepsi da Gram negativi.
La presenza di ferro, soprattutto sottoforma di NTBI, causa una moltiplicazione e disseminazione batterica particolarmente rapida di diversi ceppi di E. L’epcidina prodotta nell’epidermide è importante nella risposta alle infezioni locali, in particolare è stato dimostrato un suo ruolo essenziale nella fascite necrotizzante da Streptococco di gruppo A, temibile infezione nei soggetti immunodepressi. La produzione di epcidina è indotta nella cute dei pazienti infettati dallo Streptococco.
Dosaggio e implicazioni cliniche
L’epcidina può essere dosata nel siero con tecniche diverse: le più usate sono la spettrometria di massa e i metodi immuno-enzimatici (ELISA). Tuttavia, in mancanza di armonizzazione dei dati ottenuti con metodi diversi, il dosaggio è attualmente consigliato solo a scopo di ricerca.
Sono stati sviluppati e testati con esito positivo in studi preclinici i cosiddetti agonisti dell’epcidina, che ne mimano la funzione o influenzano l’espressione dell’ormone. La finalità terapeutica è di aumentarne i livelli per correggere sovraccarichi di ferro nell’emocromatosi e nella talassemia o per indurre sideropenia nella policitemia vera. Alcuni composti sono già entrati in fase di sperimentazione clinica (Casu C et al, 2018).