Le biotecnologie (b.), intese nel significato più ampio e moderno del termine, possono essere definite come le tecnologie che utilizzano organismi viventi o loro componenti subcellulari, al fine di ottenere la produzione di sostanze utili in quantità industriali. In particolare le b. innovative sono basate sull'uso del DNA ricombinante, sulla fusione cellulare e sul trasferimento dei geni; sono essenzialmente il risultato dell'applicazione delle conoscenze acquisite dalla biologia cellulare e molecolare, dalla genetica molecolare, dalla biochimica, dall'elettronica e dall'ingegneria, e sono ben rappresentate dall'ingegneria genetica.
La caratteristica principale delle b. avanzate è la possibilità di analizzare, modificare in modo predeterminato e controllare l'agente biologico utilizzato. Le b. non sono di per se stesse un settore produttivo, ma al contrario sono dei mezzi che possono essere utilizzati in molti di tali settori (agricoltura, industrie farmaceutica, alimentare e chimica, protezione dell'ambiente, informatica ecc.).
Negli ultimi anni le b. hanno ricevuto un notevole impulso, sia dalle nuove conoscenze in campo biologico, sia dallo sviluppo e dall'ottimizzazione di tecniche che, in parte, rappresentano la naturale evoluzione di tecnologie applicate alla biologia molecolare e, in parte, costituiscono un capitolo del tutto nuovo nella storia di questo settore. Processi o prodotti derivati dall'impiego delle b. sono ormai utilizzati con grande successo in aree che vanno dalla nutrizione alla conservazione della variabilità biologica, dalla depurazione di ambienti contaminati ai modelli animali che simulano malattie umane, fino alla terapia genica di malattie quali il cancro o l'AIDS.
L'area tecnologica che ha avuto il maggior impulso e che ha esercitato un'influenza determinante, tanto sulla ricerca di base quanto su quella applicata, rimane senza dubbio la tecnologia degli acidi nucleici, in quanto ha beneficiato dello sviluppo della tecnica chiamata reazione di polimerizzazione a catena (PCR, Polymerase Chain Reaction).
Reazione di Polimerizzazione a Catena (PCR)
La PCR consiste nell'amplificazione enzimatica in vitro di una definita sequenza di DNA. Questa amplificazione viene ottenuta mediante cicli ripetuti di polimerizzazione di desossiribonucleotidi in cui il prodotto di reazione diventa il reagente dell'amplificazione successiva, rendendo così possibile che il ciclo si ripeta un numero n di volte.
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Prima di descrivere in dettaglio la PCR, è importante ricordare che i legami idrogeno della molecola del DNA possono essere distrutti dal calore o da valori elevati di pH. Tuttavia, in seguito a raffreddamento o all'abbassamento del pH, i due filamenti tendono a riassociarsi o 'ibridare' l'uno con l'altro, tornando ad assumere la conformazione a doppia elica. Fisiologicamente, la separazione dei due filamenti della doppia elica del DNA avviene durante la sua replicazione.
I desossiribonucleotidi liberi si appaiano in modo complementare nel momento in cui le due catene di DNA vengono separate, fungendo da stampo per la sintesi di filamenti complementari. La reazione di sintesi del DNA è catalizzata da un enzima, una DNA-polimerasi, scoperto nel 1955 da A. Kornberg.
Le DNA-polimerasi possono allungare una corta sequenza di nucleotidi, il primer, legando in successione i desossinucleotidi trifosfati all'estremità 3´ del primer in crescita. Il primer si trova ovviamente già ibridato alla sequenza complementare del filamento che fa da stampo.
Alcuni anni fa, precisamente nel 1985, K. Mullis ebbe l'idea di usare un paio di primer, complementari a due sequenze nucleotidiche su ciascun filamento di DNA e delimitanti una regione genomica di interesse. Una reazione di questo genere porta alla sintesi, in direzioni opposte, di due molecole di DNA a doppia elica che, denaturate, possono poi diventare lo stampo per altri filamenti in una successione esponenziale. Questo è il semplice concetto che sta alla base della reazione di polimerizzazione a catena o PCR.
Ciclo di Amplificazione PCR
Un ciclo di amplificazione consiste schematicamente di tre fasi ed è preceduto da una fase in cui il DNA del campione in esame viene estratto e digerito con diversi enzimi di restrizione, secondo metodiche già descritte. Le fasi sono:
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- La prima fase prevede la denaturazione ad alta temperatura della doppia elica di DNA, allo scopo di separare i due filamenti.
- La seconda fase consiste nel legame dei primer, in precedenza aggiunti in eccesso alla miscela di reazione, alle sequenze di DNA a essi complementari.
- Il terzo stadio è rappresentato dalla sintesi del DNA a opera dell'enzima DNA-polimerasi.
In virtù della loro alta concentrazione, i primer si legano rapidamente alle sequenze loro complementari anticipando, quando la temperatura viene abbassata, la loro riassociazione. A seguito di un successivo riscaldamento della miscela di reazione, anche le catene di DNA neosintetizzate si denaturano aprendosi: viene così reso disponibile l'attacco dei primer per la sintesi di altre catene complementari. Il ciclo quindi riprende nuovamente.
Le prime reazioni di PCR sono state sviluppate utilizzando la DNA-polimerasi estratta da Escherichia coli. Tuttavia, durante la fase di denaturazione ad alta temperatura la polimerasi veniva inattivata ed era perciò necessario aggiungere nuovo enzima all'inizio del successivo ciclo di amplificazione: il che rendeva il metodo difficoltoso e soggetto a errori. Attualmente viene invece impiegata una DNA-polimerasi termostabile, che resiste cioè fino a temperature di 95 °C, purificata dal batterio Thermus aquaticus, un microrganismo che vive normalmente in sorgenti calde a temperature tra 70 e 75 °C. Con l'introduzione di questo enzima è stato possibile evitare di aggiungere continuamente enzima alla miscela di reazione e, cosa più importante, automatizzare completamente le varie fasi della PCR.
Il prodotto finale della reazione di polimerizzazione a catena è una certa quantità di DNA specificamente amplificato, che deve però essere evidenziato e distinto dal DNA non amplificato. A tale scopo si usano varie tecniche: la più comune risulta essere una separazione dei frammenti mediante elettroforesi in gel di agarosio, a cui fa seguito una colorazione specifica per il DNA che evidenzia la banda del prodotto di PCR, in genere molto ben visibile.
Applicazioni della PCR
Uno dei campi di applicazione più importanti, sia dal punto di vista clinico-epidemiologico che di ricerca, è la microbiologia: la tecnica può essere infatti usata per l'identificazione, in un campione di materiale infetto, di un qualsiasi patogeno di cui sia conosciuta anche solo una limitata porzione della sequenza genomica.
Sono virtualmente analizzabili mediante PCR tutte le malattie genetiche ereditarie di cui sia stato identificato il locus genetico implicato, quali, per es., le varie forme di talassemia, di emofilia, la distrofia muscolare di Duchenne e altre.
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La possibilità di rilevare il DNA anche con quantità limitate di materiale cellulare ha conferito un ruolo di particolare rilievo a questa tecnologia nella diagnostica prenatale: in questo caso sono sottoposte a PCR cellule fetali ottenute da amniocentesi o campioni di villi coriali.
Un settore che si è di recente avvalso della tecnica della PCR è quello della medicina legale, specialmente nei casi in cui i reperti contengano solo pochissime cellule: è possibile la tipizzazione del patrimonio genetico da capelli, spermatozoi e cellule del sedimento urinario.
La PCR ha permesso di conseguire rilevanti risultati anche nel campo dell'oncologia. L'identificazione di diversi elementi genetici, come oncogeni e geni oncosoppressori, fattori di crescita e loro recettori, ne ha chiarito il ruolo in relazione alla genesi e all'evoluzione delle malattie neoplastiche, rendendo possibile un approccio molecolare all'oncologia.
Mappatura e Sequenziamento dei Genomi
Lo spettacolare sviluppo delle tecniche di biologia molecolare ha aperto ampie prospettive nella direzione di uno dei grandi sogni della biologia moderna, vale a dire l'analisi dei genomi degli esseri viventi. Verso la metà degli anni Ottanta, la comunità scientifica aveva iniziato a pianificare una serie di progetti riguardanti il sequenziamento sistematico di genomi, con lo scopo di allestire uno strumento in grado di portare la ricerca biologica in ambiti ancora inesplorati.
Tra i programmi più ambiziosi figurava la mappatura e il sequenziamento del genoma di Homo sapiens, e tale progetto ha in effetti fornito la prima opportunità per una dettagliata discussione sulle implicazioni strategiche di un'iniziativa di dimensioni così grandi, ponendo altresì una serie di problemi di sviluppo tecnologico e di collaborazione internazionale per un'impresa paragonabile al programma spaziale culminato, sul finire degli anni Sessanta, con la missione dell'uomo sulla Luna.
Fu subito chiaro che i progetti di mappatura e sequenziamento dei genomi, considerando i costi, la complessità, la necessità di multidisciplinarietà e le ricadute di amplissimo respiro, non potevano essere affrontati da una sola istituzione, per quanto di grande dimensione e di alto livello di organizzazione; era invece necessaria una collaborazione mondiale che prevedesse lo sviluppo di reti di laboratori interconnessi e coordinati da centri, in grado di raccogliere tutte le informazioni messe a disposizione dai singoli laboratori.
La fine degli anni Novanta segna l'inizio dell'era 'genomica'. Per la prima volta nella storia è possibile conoscere l'intero contenuto genetico di un numero sempre crescente di organismi viventi, dall'uomo agli eucarioti, ai batteri, e aprire la strada a nuove e imprevedibili scoperte.
Sequenziamento del Genoma di Lievito
Il primo cromosoma completamente sequenziato di un organismo eucariote è stato il cromosoma iii di Saccharomyces cervisiae, un ceppo di lievito che contiene 16 cromosomi per complessivi 15 milioni di paia di basi nucleotidiche. Questo risultato è stato pubblicato nel maggio del 1992 sulla rivista Nature.
I 16 cromosomi che compongono il patrimonio genetico del lievito, nonostante le ridotte dimensioni, possiedono notevoli somiglianze con quelli degli eucarioti complessi, sia per la struttura che per i meccanismi di replicazione e segregazione. La facilità con cui possono essere manipolati utilizzando tecniche di genetica sia classica sia molecolare ha permesso di identificarne tutte le regioni funzionali, vale a dire telomeri, centromeri e origine di replicazione.
L'impresa ha riguardato 35 laboratori (di cui 4 italiani) finanziati dall'Unione Europea, con un contratto di ricerca che vincolava ogni laboratorio a sequenziare almeno 10 kilobasi del cromosoma in questione. Un gruppo così numeroso andava coordinato in modo da uniformare le finalità scientifiche dei laboratori coinvolti, molti dei quali lavoravano su differenti geni del lievito sulla base di differenti interessi di ricerca.
È in questo ambito che risulta di vitale importanza lo sviluppo della bioinformatica, che nella mappatura e nel sequenziamento dei genomi trova una delle applicazioni più adatte. Nel 1991 fu coniato il termine in silice per definire un terzo modo di studiare i meccanismi biologici, che completa quelli in vivo e in vitro e che è a questi complementare, soprattutto nei campi della genetica e della biologia molecolare.
Mai come oggi la tecnologia dell'informazione basata sui chip al silicio è entrata a far parte in modo così importante della ricerca biologica, specie delle biotecnologie. Questo nuovo approccio permette l'acquisizione e il trattamento dei dati in differenti banche di sequenze specializzate, e può inoltre costituire l'interfaccia di collegamento con banche dati che immagazzinano differenti tipi di informazioni (fisiologia, metabolismo, biochimica ecc.).
Mappatura del Genoma di Topo
Nell'ottobre 1993 venne pubblicata sulla rivista Science la mappa genetica del topo, la prima relativa a un mammifero nella storia della biologia moderna. Il topo, dato il breve periodo di gestazione e le grandi possibilità di incrocio, è stato l'animale da laboratorio d'eccellenza anche per gli studi di genetica classica.
Recentemente, sono state sviluppate tecnologie che consentono di inserire in cellule embrionali di topo geni umani, e questi possono in seguito essere espressi nel corso dello sviluppo e del differenziamento dell'animale; sono stati in tal modo creati animali transgenici, in cui possono essere studiate le funzioni di tali geni mediante mutazioni che possono inattivarli o aumentarne il grado di attività.
Come per la mappa genetica umana, la mappa genetica del topo serve per due scopi distinti. Innanzitutto, essa fornisce uno strumento per l'analisi genetica, e quindi - date le possibilità di manipolazione - permette la mappatura di mutazioni che causano caratteristiche fenotipiche particolarmente interessanti, la localizzazione cromosomica di geni già clonati e sequenziati e la creazione di animali genotipicamente ben definiti.
In secondo luogo, l'allestimento delle mappe genetiche - che è uno stadio imprescindibile per poter poi sviluppare le mappe fisiche - fornisce le indicazioni necessarie per ordinare gli YAC (Yeast Artificial Chromosome) contenenti i vari segmenti contigui del genoma del topo.
È stata quindi preparata una mappa genetica dei 21 cromosomi di topo basata su 2616 loci, portando il potere di definizione della mappa a circa 0,6 cM (il centiMorgan dà una stima della distanza tra un gene e un altro ed è basato sulla frequenza di ricombinazione cromosomica che si instaura al momento della meiosi).
Un settore che potrà trarre vantaggio da questi studi è sicuramente la ricerca sul cancro, in quanto da tempo è noto che una degenerazione genetica, a carico di determinate regioni cromosomiche, è responsabile dell'insorgere e della progressione della malattia tumorale. Queste regioni possono essere riconosciute in quanto i marcatori genetici nei tessuti normali risultano eterozigoti, mentre nei tessuti cancerosi si osserva l'instaurarsi dello stato omozigote.
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