La proteina prionica cellulare (PrPC) è una glicoproteina di membrana altamente conservata nei mammiferi e abbondantemente espressa nei neuroni. La proteina PrPC è composta da 253 amminoacidi, ha un peso complessivo di 33 - 35 kDa e viene espressa in maniera ubiquitaria soprattutto a livello del sistema nervoso.
Struttura e Modificazioni Post-Traduzionali della PrPC
La proteina prionica cellulare di membrana (PrPC) è codificata dal gene PRNP situato sul braccio corto del cromosoma 20 dell'uomo e, sebbene sia composto da due esoni, l'intero "open reading frame (ORF)" è localizzato solo nel secondo esone.
A livello post - traduzionale avvengono tre modificazioni principali che sono:
- N - glicosilazioni che danno origine a tre isoforme: monoglicosilata, diglicosilata e non glicosilata
- la rimozione proteolitica di un peptide di 22 amminoacidi all'estremità N - terminale
- la sostituzione del C - terminale con un complesso glicosil - fosfatidilinositolo (GPI) per l' ancoraggio della proteina alla membrana citoplasmatica.
Funzioni Fisiologiche della PrPC
Nonostante i progressi compiuti dagli studi, non è stato però ancora possibile giungere a evidenze conclusive in merito a quale sia l'esatto ruolo fisiologico della PrPC.
Il ruolo della PrP non è ancora stato chiarito, anche se sono state proposte diverse ipotesi sulla sua funzione:
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- Omeostasi del rame
- Interazione con laminina -> Adesione cellulare/sviluppo di neuriti
- Regolazione del flusso di ioni Ca++ -> Trasmissione sinaptica
- Espressa per lo più a livello del sistema nervoso -> Trasduzione del segnale nervoso
- Azione anti ossidante
- Regolazione del ritmo circadiano
- Azione anti apoptotica
Recenti studi hanno evidenziato che la somministrazione di anticorpi anti-PrPC rallenta la formazione di PrPEST negli animali infetti con conseguente ritardo della comparsa di segni clinici.
Secondo le nuove osservazioni la proteina nella sua forma fisiologica svolge un’importante funzione di promozione della crescita dei neuriti, le proiezioni dei neuroni lungo le quali viaggia il segnale nervoso.
In questo lavoro, che è stato svolto in collaborazione con l’Optical Manipulation Lab (CNR- IOM, Trieste), è stata usata una tecnica innovativa che ha permesso di osservare da vicino l’interazione fra PrPC e i neuriti in fase di crescita.
La metodologia, sviluppata da Dan Cojoc, ricercatore SISSA/CNR-IOM, prevedeva l’inserzione delle proteine PrPC all’interno di micro vescicole che venivano poi poste con precisione, con delle pinzette ottiche, in vicinanza dei coni di crescita di neuroni ippocampali.
I coni di crescita sono porzioni “attive” della membrana del neurone dove si svolge la crescita del neurite. Con questa tecnica di precisione è stato possibile osservare la reazione del cono di crescita a basse concentrazioni di proteina prionica.
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Negli esperimenti la presenza di PrPC provocava il rapido accrescimento dei neuriti e il posizionamento del cono di crescita in direzione della massima concentrazione di proteina prionica.
Quando una molecola interagisce selettivamente con molecole a lei identiche, come in questo caso, si parla di interazione “omofilica”.
È stato visto che NCAM si lega in maniera molto stretta con il terminale N della proteina prionica, spiega Gabriele Giachin, ex studente e ricercatore SISSA, attualmente in forza al European Synchrotron Radiation Facility di Grenoble in Francia, che insieme a Giulia Salzano, dottoranda della SISSA, ha contribuito allo studio.
PrPC è infatti costituita da due domini: una parte strettamente impacchettata che per sua natura non interagisce con altre molecole, e una parte non strutturata, libera, il terminale N, che è invece la zona attiva della molecola.
I due studi si completano, offrendo il primo una visione d’insieme dell’intero processo e il secondo un focus su uno stadio importante, formando insieme un quadro coerente.
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La Conversione in PrPSc e le Malattie da Prioni
La PrPC diviene pericolosa in seguito ad un mutamento conformazionale che può essere indotto da un prione infettante esogeno. Il prione esogeno si inserisce nella membrana plasmatica, dove è presente la proteina prionica cellulare, e venendone in contatto diretto ne causa la conversione con un meccanismo ancora sconosciuto.
Una volta formata, la PrPSC, induce cambiamenti conformazionali nelle altre PrPC attraverso un meccanismo autocatalitico fino a quando non viene raggiunta una concentrazione critica che porta all'aggregazione delle proteine stesse (fibre amiloidi) e al danneggiamento del tessuto nervoso.
È stato osservato che può anche avvenire una mutazione genetica spontanea che porta alla formazione di PrPSC che agisce su altre PrPC con una reazione a catena.
Anche se la formazione della PrPSC dalla PrPC è un processo post traduzionale nessuna modificazione chimica è stata identificata. Ciò suggerisce che la sintesi di PrPSC sia dovuta ad un cambiamento conformazionale.
Lo spettro ricavato dall'analisi FT IR della proteina purificata ha dimostrato che PrPC , presenta un picco simmetrico con un massimo a 1653 cm-1. Tale spettro è caratteristico delle proteine con un elevato contenuto in α elica (42%) e non in foglietto β (3%), queste proporzioni sono state poi confermate tramite DC (Dicroismo Circolare); al contrario PrP presenta un elevato contenuto di foglietti - β (43%) e un basso contenuto in α - eliche (30%).
Da diversi studi è stato rilevato che il frammento, derivato da una parziale proteolisi della PrPSC e responsabile della formazione di fibre amiloidi è il PrPSC 27-30, costituito da 142 amminoacidi, che presenta un contenuto del 50% di foglietti - β pieghettati a bassa frequenza, ciò riflette una associazione intermolecolare che caratterizza le fibre amiloidi.
Le PrPSC perdono la loro funzione e tendono ad accumularsi nella sostanza grigia formando le placche amiloidi.
Le principali malattie causate da prioni sono quindi a carico del sistema nervoso, sono neurodegenerative e vengono classificate in Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili (TSE):
| Specie | Malattia |
|---|---|
| UOMO | malattia di Creutzfeldt Jakob (MCJ) |
| UOMO | sindrome di Gerstmann Straussler Scheinker (GSS) |
| UOMO | insonnia familiare fatale (IFF) |
| ANIMALI | scrapie della pecora e della capra |
| ANIMALI | encefalite spongiforme del bovino (BSE) |
| ANIMALI | encefalite trasmissibile del visone (TME) |
| ANIMALI | malattia cronica devastante del cervo (CWD) |
Meccanismi di Neurodegenerazione
Un recente studio ha identificato come punto centrale del processo di neurotossicità la proteina prionica cellulare, che funzionerebbe da recettore ad alta affinità per gli oligomeri di beta-amiloide sui neuroni.
L’interazione tra oligomeri e prione non richiede la presenza della proteina prionica nella conformazione alterata (scrapie) responsabile della malattia di Creutzfeldt-Jacob.
In modelli murini, anticorpi anti-prione prevengono il legame degli oligomeri di beta-amiloide alla proteina prionica cellulare e ristabiliscono la funzionalità sinaptica ippocampale.
PrPC e Omeostasi del Calcio
Riguardo alla biologia della PrPC, numerose evidenze sperimentali le hanno attribuito un numero elevato di ruoli, la maggior parte dei quali si esplicherebbe attraverso il coinvolgimento della proteina in multiple vie di segnalazione.
Un’ipotesi che più si adatta a tale comportamento multi-sfaccettato, è che la funzione della PrPC si esplichi agendo su un fattore a sua volta multi-potente - in grado quindi di controllare numerosi eventi cellulari - qual’è, ad esempio, lo ione Ca2+.
In questo lavoro di tesi, è stata cercata la validazione di quest’ipotesi comparando, in colture primarie di neuroni granulari di cervelletto ottenuti da topi wild-type o privi di PrPC, sia i movimenti locali di Ca2+ sia l’espressione dei sistemi più importanti deputati all’omeostasi dello ione.
Dai risultati ottenuti è emerso che, rispetto a quando è presente, l’assenza della PrPC è causa di alterazioni dei movimenti dello ione in questi domini, ma anche della diversa espressione di canali, o di pompe, per il Ca2+.