Una delle applicazioni più comuni nell’ambito biotech è l’espressione di proteine ricombinanti; con proteine ricombinanti vanno intese proteine prodotte sfruttando tecniche di ricombinazione del DNA in vitro.
Cosa Sono le Proteine Ricombinanti?
Le proteine sono degli elementi fondamentali nei processi biologici di una cellula. Cosa sono le proteine ricombinanti e quali sono le differenze rispetto alle proteine tradizionali? Le proteine ricombinanti sono proteine codificate dal DNA ricombinante. Si tratta di un DNA clonato in un vettore di espressione e che supporta allo stesso tempo l’espressione del gene e la traduzione dell’RNA messaggero.
La stragrande maggioranza delle proteine di questo tipo che vengono utilizzate per uso terapeutico provengono dall’uomo. Sono espresse in termini di microrganismi come batteri, lieviti oppure cellule animali. Inoltre, i geni umani sono molto complessi perché contengono sequenza di DNA non codificate chiamate introni.
Produzione di Proteine Ricombinanti
La tecnologia del DNA ricombinante ha permesso di produrre in larga quantità diversi tipi di proteine, dette ricombinanti, utilizzando le cellule batteriche o quelle eucariotiche come 'biofabbriche'. In questo modo si producono molti biofarmaci (tra cui l'ormone insulina, fattori della coagulazione, diversi vaccini) e altri prodotti utili per l'uomo (come vari enzimi per uso industriale).
Per ottenere le proteine ricombinanti si utilizzano vettori di espressione, ovvero dei vettori di clonaggio con caratteristiche aggiuntive che consentono un'efficiente espressione del gene esogeno in proteina. Il gene (oppure il cDNA) esogene codificante per le proteina di interesse viene inserito nel vettore della pressione e il vettore ricombinante viene poi introdotto nella cellula ospite, come il batterio Escherichia coli, per la coltura in massa e la produzione della proteina. Nella maggior parte dei casi si scelgono come ospiti organismi ampiamente conosciuti dal punto di vista biologico, i cosiddetti organismi modello. Ad esempio, per i procarioti il più usato è E. A questo punto i nostri ospiti inizieranno ad esprimere il gene contenuto nel plasmide acquisito esattamente come accade per i geni del loro genoma.
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Un altro aspetto da non trascurare è il fatto che l’ospite, oltre a produrre la proteina di interesse è impegnato nel proprio metabolismo cellulare; quindi avremo diverse proteine e non soltanto quella da noi ricercata. Produrre proteine ricombinanti per fini di ricerca è conveniente perché è molto economico, semplice e veloce.
E’ importante ricordare che la maggior parte delle proteine ricombinanti richiedono delle modifiche proteiche. Attualmente, la maggior parte delle proteine terapeutiche ricombinanti sono prodotte nelle cellule di mammifero perché le cellule di mammifero sono in grado di produrre proteine di alta qualità simili a quelle presenti in natura.
Purificazione delle Proteine Ricombinanti
Le istidine infatti, così come la streptavidina, sono funzionali allo step di purificazione condotto mediante cromatografia.
Applicazioni delle Proteine Ricombinanti
Le destinazioni di utilizzo delle proteine ricombinanti sono numerose. Per esempio, sono dedicate anche al settore dell’allevamento. Un ultimo aspetto è che i LAB (batteri dell’acido lattico) sono stati adoperati per garantire la produzione di alimenti fermentati. I batteri dell’acido lattico sono stati progettati anche per la realizzazione di proteine ricombinanti. Queste potranno avere diversi ambiti di applicazione sia in termini di miglioramento della digestione e sia della nutrizione animale e umana.
Vaccini Ricombinanti
I vaccini ricombinanti si basano sull’espressione delle regioni immunogeniche di un patogeno in un ospite eterologo da cui l'antigene protettivo viene successivamente purificato ed utilizzato nella formulazione del vaccino. Per lo sviluppo di un vaccino a base di antigene proteico, il punto di partenza è la caratterizzazione di composti proteici da patogeni batterici mediante elettroforesi bidimensionale denaturante su gel di poliacrilammide (2D-SDS-PAGE).
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L'analisi Western blot condotta utilizzando i sieri raccolti da pesci infettati / sopravvissuti all’infezione permette di identificare l'antigene o gli antigeni immunogenici, facilmente riconoscibile dal sistema immunitario dell'ospite ed in grado di stimolarne la risposta. Una volta identificate le proteine immunogeniche, è possibile produrle in grandi quantità con la tecnologia del DNA ricombinante, purificarle e utilizzarle per vaccinare i pesci.
La produzione di proteine ricombinanti ha diversi vantaggi: è economico coltivare i batteri, produrre vaccini su larga scala, ed inoltre questi vaccini sono sicuri ed economici rispetto ai vaccini a base di batteri vivi attenuati, che potrebbero tornare ad essere patogeni.
Attualmente sono disponibili vaccini autologhi e commerciali adiuvati per la lattococcosi. Tutti questi vaccini devono essere somministrati per iniezione con procedure a volte troppo complesse e costose per i sistemi di allevamento su piccola scala. La loro efficacia è limitata nello spazio (autologo) e nel tempo.
Questo problema, nel Progetto SUPERTROUT, verrà affrontato modificando i metodi di produzione e somministrazione, cercando di sviluppare un vaccino a proteine ricombinanti da somministrare per immersione. Questo è l'obiettivo chiave del Work Package 3 del Progetto SUPERTROUT, in cui le competenze e le conoscenze dei diversi Partner verranno combinate per sviluppare un vaccino efficace per combattere la lattococcosi nella trota iridea.
Farmaci Biotecnologici
La produzione di proteine ricombinanti mediante processi biotecnologici garantisce l’ottenimento di farmaci ad elevato grado di purezza e sicuri in quanto privi dei contaminanti quali virus o altri agenti infettivi. Inoltre, permette di disporre delle crescenti quantità di farmaco necessarie, eliminando la precarietà dell’approvvigionamento dagli organi animali, utilizzati in passato per la produzione di particolare farmaci come ad esempio l’insulina ottenuta dal pancreas di maiale.
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Le proteine ricombinanti coprono oggi un ampio spettro nel trattamento di patologie di elevata rilevanza sociale come per esempio l’insulina umana nel diabete mellito. Infatti, nei primi anni ’80, la prima proteina terapeutica in assoluto ottenuta mediante la tecnologia del DNA ricombinante è stata l’insulina umana ricombinante, la quale ha permesso di risolvere importanti problemi conseguenti alle reazioni dell’organismo ad uno ormone simile, ma non uguale, a quello umano.
Un’altra “famiglia” di proteine molto interessante è quella degli interferoni, dotati di attività antivirale e antitumorale: scoperti nel 1957, sono proteine prodotte dalla maggior parte delle cellule di tutti i vertebrati quando adeguatamente stimolate, ed hanno un’azione specie-specifica (es. l’interferone dei topi agisce solo nei topi e quello umano solo nell’uomo). Ma la quantità prodotta nell’organismo umano in condizioni normali è così bassa da rendere impensabile ottenerli per estrazione per qualsiasi applicazione pratica in campo terapeutico.
A partire dai primi anni’80 invece, grazie al DNA ricombinante, le sequenze codificanti per gli interferoni sono state “trapiantate” in batteri, rendendone così possibile la produzione su larga scala. In terapia si sfruttano in particolare le loro attività antivirale e antitumorale. Nel trattamento dei tumori, gli interferoni sembrano arrestare la proliferazione delle cellule cancerogene, e in molti casi si osserva una riduzione della massa tumorale.
Terapia Genica e Altre Applicazioni Mediche
Le tecniche basare sul DNA ricombinante hanno numerose applicazioni in campo medico, per esempio nella diagnosi o nella terapia di malattie genetiche dovute all'alterazione di uno o più geni. La terapia genica si basa sull'inserimento di copie "normali" del gene nelle cellule malate, per ripristinare la corretta espressione della proteina funzionale.
I primi sono i farmaci più comuni. I farmaci biologici, ad esempio gli ormoni, le proteine o gli anticorpi, sono una classe di farmaci che, a causa della loro grandezza, non possono essere prodotti attraverso la sintesi chimica. Alcune di queste molecole vengono estratte, e in seguito purificate, da cellule cresciute in vitro in laboratorio. Altre si ottengono a partire da organi vegetali, animali o umani.
Gli emoderivati come albumina, immunoglobuline e fattori di coagulazione, ad esempio, sono medicinali estratti dal sangue o dal plasma umano, ottenuto mediante donazioni volontarie. Gli straordinari progressi biotecnologici degli ultimi anni hanno permesso lo sviluppo di una nuova sottoclasse di farmaci biologici, e cioè i farmaci biotecnologici. Questi ultimi si ottengono mediante processi di estrazione e purificazione a partire da cellule modificate ad hoc grazie all’ingegneria genetica.
Interi geni di interesse o più semplicemente piccole sequenze di DNA vengono isolati e modificati per creare nuovi geni con proprietà specifiche. Queste informazioni genetiche così modificate vengono poi introdotte in cellule “ospiti” in modo che il “messaggio” contenuto nel DNA si trasformi in proteine corrispondenti, in gergo ricombinanti. Anche il vaccino per l’epatite B è un farmaco biologico: in questo caso, la proteina ricombinante è quella che riveste il virus. Gli anticorpi prodotti dal sistema immunitario in risposta a questa proteina saranno in grado di proteggerci dall’infezione. La proteina del vaccino per l’epatite B è ottenuta mediante tecnologia del DNA ricombinante in cellule di lievito.
Proteine di Fusione e Anticorpi Monoclonali
Un altro tipo di farmaco biologico è rappresentato dalle proteine di fusione, o proteine chimeriche. Un esempio è rappresentato dall’Etanercept, un farmaco biologico utilizzato per il trattamento di malattie infiammatorie croniche (ad esempio l’artrite reumatoide o la psoriasi). Una parte di questa molecola interagisce in modo molto specifico - e blocca- la citochina infiammatoria TNF-alfa; l’altra parte di molecola, fusa alla prima, è la porzione costante dell’immunoglobulina umana IgG1 (Fc), porzione che le permette di restare nel circolo sanguigno e quindi di funzionare più a lungo (in gergo a lunga emivita).
In generale, gli anticorpi sono prodotti dal sistema immunitario per difendersi dall’attacco di agenti identificati come estranei (es. batteri, virus, tossine o anche componenti di cellule tumorali). Nella produzione degli anticorpi monoclonali è proprio la parte variabile ad essere “progettata” sulla base della struttura degli agenti estranei o antigeni (ad esempio, per riconoscere la proteina spike presente sul virus del Covid-19). Questo permette all’anticorpo di legarsi con alta affinità solo a quello specifico antigene e a nessun altro.
La scoperta della possibilità di produrre anticorpi monoclonali risale al 1975: la tecnica prevede di iniettare nel topo l’antigene, che produce quindi al nostro posto gli anticorpi. Il complesso linfocita B-cellula immortalizzata, chiamato ibridoma, funzionerà da catena di montaggio per la produzione di grandi quantità di anticorpi monoclonali. Purtroppo, essendo murini, e cioè prodotti dal topo, una volta iniettati nell’uomo questi anticorpi possono essere riconosciuti come estranei attivando, come meccanismo di difesa, il sistema immunitario.
Per questo motivo, sono state sviluppate nuove tecniche che permettono di produrre anticorpi costituiti dalla porzione variabile murina e dalla porzione costante umana, definiti chimerici o umanizzati, o addirittura totalmente umani. La funzione principale degli anticorpi coniugati a farmaci chimici è quella di indirizzare in modo preciso il farmaco solo sulla cellula malata e non sulla cellula sana, sfruttando la presenza di particolari antigeni. Un esempio è il trastuzumab-emtansine, utilizzato in pazienti affette da uno dei tumori mammari più aggressivi, e cioè il tumore mammario HER2-positivo. L’anticorpo si lega in maniera specifica alle cellule tumorali che mostrano sulla loro superficie una particolare proteina, chiamata recettore di HER2.
Utilizzo Clinico degli Anticorpi Monoclonali
Qual è l’utilizzo degli anticorpi monoclonali? Il primo anticorpo terapeutico ricombinante è stato approvato nel 1986. Nel 2019 erano 79 gli anticorpi approvati, 18 solo nell’ultimo anno. Quali sono, però, le loro principali applicazioni cliniche? Trattandosi di proteine, non possono essere assunti per bocca, in quanto verrebbero digerite nello stomaco. Trattandosi di grandi molecole, non passano le barriere biologiche e quindi possono interagire solo con “bersagli” presenti sulla superfice esterna delle cellule o circolanti nel sangue. Infine, hanno un costo elevato dovuto soprattutto alla necessità di garantirne la qualità e la riproducibilità.
Biosimilari e Monitoraggio Terapeutico
La disponibilità di biosimilari è molto importante per la sostenibilità del Sistema Sanitario Nazionale, tenendo conto dell’alto costo dei farmaci biologici e del loro utilizzo sempre più diffuso. Un aspetto molto più importante è rappresentato invece dalle differenze individuali tra pazienti, che possono determinare differenze importanti nell’efficacia clinica o negli effetti collaterali del farmaco. in alcuni pazienti, ma non in altri, il farmaco scateni una reazione immunitaria portando alla produzione di anticorpi-antifarmaco.
La misurazione delle concentrazioni di farmaco e degli anticorpi anti-farmaco nel sangue si chiama monitoraggio terapeutico. La metodica più conosciuta di monitoraggio terapeutico è il test ELISA, il cui nome è un acronimo che sta per Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay o saggio immuno-assorbente legato ad un enzima. Le molecole da misurare (ad esempio i farmaci biologici presenti nel sangue) sono “catturate” dal corrispondente anticorpo legato su una superficie, e quantificate con metodi indiretti basati generalmente sulla fluorescenza. Seppure molto usato per la sua relativa semplicità, questo saggio presenta alcune limitazioni, dovute alla necessità di molti passaggi che ne aumentano il tempo di esecuzione e la riproducibilità.
Il nuovo test è una originale applicazione della tecnologia chiamata ‘risonanza plasmonica di superficie’, nella quale gli anticorpi di interesse (sia il farmaco e che gli anticorpi anti-farmaco) sono ‘catturati’ da un microchip che funziona da biosensore. Nella tecnologica della Risonanza Plasmonica di Superficie, il sangue, contenente gli anticorpi da misurare, viene fatto scorrere sul microchip sul quale sono presenti i corrispondenti antigeni. Il legame specifico tra anticorpo e antigene induce dei cambiamenti sulla superficie d’oro del microchip, la cosiddetta “risonanza plasmonica di superficie”, che viene misurata in tempo reale.
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