La replicazione del DNA è un processo fondamentale per la trasmissione dell'informazione genetica e avviene durante la fase S del ciclo cellulare. In questo contesto, le proteine SSB (Single Strand Binding Proteins) svolgono un ruolo cruciale.
Il Processo di Replicazione del DNA
Durante la replicazione del DNA, il doppio filamento è prima despiralizzato grazie alla topoisomerasi, quindi separato grazie alla elicasi. Varie proteine dette SSBP (Single Strand Binding Protein: proteina legante il singolo filamento) tengono aperto il doppio filamento di DNA per permettere la copia. Ogni filamento di DNA serve come stampo per la sintesi di un nuovo filamento, prodotto grazie alla DNA polimerasi.
L'attività della DNA polimerasi (la II) è stimolata dalle proteine SSB (Single Strand Binding Proteins) nel caso delle cellule procariote. Il processo di duplicazione del DNA è detto replicazione. Durante la replicazione del DNA la direzione di sintesi è da 5' a 3'. Tutte le DNA polimerasi conosciute sintetizzano il nuovo filamento in direzione 5'- 3' aggiungendo deossiribonucleotidi (dNTP) al gruppo 3'-OH del deossiribosio del nucleotide precedente.
Nessuna DNA-polimerasi nota è in grado di iniziare la sintesi di un filamento "da zero" (ex novo). Per questa ragione le DNA-polimerasi necessitano di inneschi (in inglese "primers") a cui aggiungere il primo nucleotide. Tali inneschi possono essere sia di DNA sia di RNA. Durante la replicazione in vivo tali inneschi di RNA sono forniti da una speciale RNA polimerasi detta primasi. Questi inneschi verranno poi eliminati grazie ad alcuni tipi particolari di RNAsi, enzimi capaci di degradare l'RNA.
Sarà poi compito dell'enzima DNA ligasi legare l'estremità 3' del nuovo tratto sintetizzato con l'estremità 5' del tratto di DNA precedente. I retrovirus possiedono una particolare DNA-polimerasi chiamata transcrittasi inversa, che è una DNA-polimerasi RNA-dipendente (RdDp) ed è in grado di sintetizzare un filamento di DNA partendo da uno stampo di RNA.
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Ruolo degli Enzimi nella Duplicazione del DNA
Gli enzimi sono fondamentali nella duplicazione del DNA, poiché facilitano la separazione dei filamenti e l'aggiunta di nuovi nucleotidi. La replicazione avviene in modo semiconservativo, con la DNA polimerasi che aggiunge nucleotidi al filamento stampo.
Telomeri e Duplicazione del DNA
I telomeri proteggono le informazioni genetiche durante la duplicazione del DNA. Il controllo avviene attraverso la selezione delle basi e la correzione di bozze. La DNA polimerasi verifica l'appaiamento corretto dei nucleotidi e rimuove quelli errati.
Sequenze Ripetute nel DNA
Esistono tre tipi di sequenze ripetute: ripetizioni brevi in tandem, sequenze moderatamente ripetute, e sequenze altamente ripetute.
Replicazione nei Procarioti: E. coli
In questo articolo, focalizzeremo l’attenzione sul processo di replicazione che interessa i procarioti, in particolare E. L’inizio della replicazione non avviene in qualunque sito ma in corrispondenza di una particolare sequenza di DNA, l’origine di replicazione, che nei procarioti prende il nome di oriC.
L’oriC di E. coli ha un’estensione di 245 pb in cui sono presenti 3 ripetizioni di 13 pb e 4 ripetizioni di 9 pb. L’oriC viene riconosciuta da parte di una proteina (DnaA). In particolare, DnaA riconosce prima le ripetizioni di 9 pb e in un secondo momento le ripetizioni di 13 pb. Questo legame determina una denaturazione al livello dell’origine di replicazione che si accompagna all’associazione di altre proteine.
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DnaB-DnaC formano un complesso proteico con attività elicasica che catalizza la separazione dei due filamenti di DNA grazie all’energia derivante dall’idrolisi dell’ATP. Una componente fondamentale in questo contesto è rappresentata dalle proteine SSB che stabilizzano i tratti a singolo filamento che sono presenti al livello della bolla di replicazione per azione dell’attività elicasica.
Tuttavia, l’inizio vero e proprio della replicazione necessita di un’estremità 3’OH, tali inneschi vengono sintetizzati in E. coli da specifiche proteine che prendono il nome di DNA primasi. Quest’ultima è deputata alla sintesi di una sequenza di ribonucleotidi, gli RNA primers. A partire da questo innesco ha inizio la polimerizzazione del DNA ad opera DNA polimerasi III. Tale enzima viene anche definito come oloenzima ossia, un complesso proteico costituito da diverse subunità e avente due nuclei catalitici responsabili della replicazione di entrambi i filamenti di DNA.
Al livello dell’oloenzima possiamo riconoscere un complesso gamma con attività ATPasi DNA dipendente, un complesso beta detto anche beta-clamp poiché afferra proprio come una pinza il DNA a singola elica e, un complesso o nucleo catalitico; quest’ultimo è formato a sua volta da 3 subunità: la subunità alfa avente il ruolo polimerizzante, la subunità epsilon avente attività esonucleasica 3’-5’ e infine, la subunità teta che stimola l’attività della subunità epsilon.
La replicazione via via procede fino a quando il macchinario di replicazione non incontra delle specifiche sequenze che prendono il nome di sequenze nucleotidiche ter. Tali sequenze legano una particolare proteina ter binding protein (TBP) che bloccano l’avanzamento della forcella di replicazione.
Le Tappe della Replicazione
La sintesi dei due filamenti complementari avviene contemporaneamente e richiede un gran numero di enzimi (complesso di duplicazione) con un processo assai preciso e accurato. Il processo si attua in due momenti: inizio e allungamento.
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Inizio
In questa prima tappa si ha la despiralizzazione del DNA per la rottura dei legami idrogeno. La duplicazione non parte dall'inizio del cromosoma ma in punti ben definiti, ricchi di A e T - più facili da separare perché tra queste basi ci sono solo due legami idrogeno -, detti punti di origine della duplicazione, e rappresentano segnali di attacco di una proteina iniziatrice, che ha il compito di tendere i due filamenti.
Di seguito intervengono altre proteine del complesso di duplicazione. La DNA elicasi si lega alla proteina iniziatrice e forza l'apertura della doppia elica, grazie all'energia fornita dall'ATP, rompendo i legami idrogeno tra le basi azotate. Le proteine SSB stabilizzano i due filamenti impedendo che i filamenti si riassocino. La topoisomerasi (DNA girasi nei Procarioti) impedisce il superavvolgimento del DNA.
L'azione combinata di queste proteine consente l'apertura di una bolla di replicazione nei Procarioti - o più bolle contemporaneamente negli Eucarioti - formata da due forcelle di replicazione a forma di Y.
Allungamento
L'allungamento consiste nell'aggiunta progressiva di nucleotidi trifosfati complementari a quelli presenti nei due filamenti stampo di DNA, secondo le regole di appaiamento. I nucleotidi formano legami fosfodiesterici tra il gruppo ossidrile all'estremità 3' del filamento preesistente e il fosfato del nuovo nucleotide. L'energia è fornita dalla liberazione dei due gruppi fosfato.
La formazione dei nuovi filamenti avviene nelle due direzioni a partire dall'origine della duplicazione. L'appaiamento corretto è reso possibile da una categoria di enzimi chiamate DNA polimerasi, che presentano due restrizioni: non possono far iniziare nuove catene, cioè quelle con una terminazione 5' libera, ma sono in grado aggiungere nucleotidi solo ad altri nucleotidi già correttamente appaiati e possono aggiungere nucleotidi solo all'estremità 3', dove è presente il gruppo -OH. Di conseguenza, l'allungamento del nuovo filamento può avvenire solo in direzione 5' → 3'.
La prima condizione è superata grazie all'enzima primasi, che crea una corta catena di una decina di nucleotidi di RNA funzionanti da innesco, o primer, e consentono alla DNA polimerasi di iniziare l'aggiunta di nucleotidi. Alla fine della duplicazione l'innesco è sostituito da DNA da una DNA polimerasi.
I due filamenti del DNA sono antiparalleli perciò uno, detto guida (o anticipato, o veloce), si trova nella corretta direzione (5' → 3') e la DNA polimerasi può procedere in modo continuo verso la forcella di replicazione, avendo bisogno di un solo innesco. Nel filamento 3' → 5' (in ritardo o lento) la sintesi avviene a ritroso in pezzi detti frammenti di Okazaki, ciascuno dei quali richiede un innesco. I frammenti sono poi uniti da una ligasi dopo aver rimosso l'innesco e riempito la parte mancante, purché i monconi siano perfettamente adiacenti.
Schema delle Tappe di Replicazione
- Una proteina iniziatrice separa i due filamenti della doppia elica e altri enzimi aprono una bolla di replicazione.
- La primasi sintetizza un frammento di RNA che funziona da innesco (primer).
- Una DNA polimerasi allunga la catena (filamento guida) in modo continuo sul filamento stampo 3' e in frammenti di Okazaki nello stampo 5', partendo dalla terminazione 3'-OH dell'RNA.
- La DNA polimerasi nei Procarioti, o DNA polimerasi con altri enzimi ad attività esonucleasica negli Eucarioti, rimuove il primer.
- Una DNA polimerasi riempie il vuoto lasciato dall'RNA.
- La ligasi unisce i frammenti.
Correzione degli Errori
Per quanto accurata sia la duplicazione, si possono presentare errori di appaiamento delle basi oppure modifiche dovute a cause esterne durante la vita cellulare. Le cellule possiedono diverse modalità per rimediare agli errori:
- Correzione di bozze (proofreading): Durante l'allungamento del filamento, la Dna polimerasi fa un controllo immediato della correttezza degli appaiamenti e, in caso di errore, retrocede fino ad incontrare un nucleotide appaiato correttamente, sostituisce subito il nucleotide errato con quello giusto e poi procede con l'aggiunta di nuovi nucleotidi. Questa operazione è possibile in quanto la DNA polimerasi, oltre ad avere la capacità di polimerizzazione, possiede un'attività di esonucleasi in direzione 3' → 5'.
- Riparazione di errato appaiamento: Al termine della duplicazione, se è sfuggito un errore, un'altra DNA polimerasi, insieme a diversi enzimi, rileva errori di appaiamento da anomalie chimiche o strutturali della doppia elica. Un secondo complesso di enzimi con attività di esonucleasi apre una bolla e rimuove il nucleotide errato insieme a quelli adiacenti, dopo aver tagliato il DNA in un solo punto. Una DNA polimerasi riempie gli spazi con i nuovi nucleotidi e, alla fine, la ligasi salda i due monconi.
- Escissione: Un terzo processo di correzione si ha al di fuori della duplicazione, durante tutta la vita della cellula. Alcuni enzimi riconoscono le parti modificate del DNA a causa di agenti fisici, come i raggi UV, o chimici.
Telomeri e Telomerasi
Nei cromosomi degli Eucarioti, che sono lineari, la rimozione dell'innesco terminale del filamento lento lascia un vuoto che non può essere sostituito da nuovo DNA in quanto manca un'estremità 3' che la DNA polimerasi possa prolungare, perciò le estremità 5' del filamento stampo non vengono duplicate. Rimane dunque un pezzettino di filamento di DNA singolo che viene tagliato insieme a una piccola porzione di filamento doppio e questo provoca l'accorciamento di circa 50-200 basi del filamento ritardato a ogni duplicazione. Le cellule, dopo 20 - 30 cicli di duplicazione muoiono.
Per evitare questo problema, alcuni cromosomi sono dotati di telomeri alle estremità, sequenze ripetute moltissime volte, che possono essere perdute senza danno. Le cellule del midollo osseo e quelle germinali, invece, sono dotate di telomerasi, un insieme di proteine ed RNA, in grado di aggiungere unità telomeriche.
Duplicazione del DNA: Aspetti Chiave
Già nel 1953, quando Watson e Crick annunciarono alla comunità scientifica la scoperta della struttura del DNA, essi stessi postularono che la duplicazione del DNA dovesse avvenire in modo semiconservativo. Secondo Watson e Crick, la stessa complementarietà delle basi azotate lasciava supporre che le due eliche si separassero per fungere ciascun da stampo per la sintesi di un filamento nuovo.
La duplicazione della doppia elica di DNA richiede innanzitutto che i due filamenti vengano separati rompendo i legami a idrogeno tra le coppie di basi azotate complementari. Gli elementi indispensabili all'avvio della duplicazione di DNA: DNA elicasi, DNA topoisomerasi, proteine SSB. In essa si assemblano due forche di replicazione che procedono in direzione opposta, fino a incontrarsi in una regione pressoché opposta a oriC, detta sito di terminazione (terC) in cui l'incontro delle due forcelle segnala la fine della duplicazione del DNA.
Il DNA eucariotico viene invece duplicato in poche ore perché esistono più origini di replicazione. La sintesi del filamento nuovo avviene ad opera dell'enzima DNA polimerasi che, tuttavia, non è in grado di iniziare la sintesi di una nuova catena, ma di allungare in direzione 5'-3' un tratto di DNA preesistente.
A questo scopo, una volta avvenuta la separazione delle due eliche, l'enzima primasi (una RNA polimerasi) crea un piccolo tratto di RNA, detto primer o innesco, che viene allungato dalla DNA polimerasi mediante l'aggiunta di deossinucleotidi, rispettando la complementarietà delle basi azotate rispetto a quelle dello stampo. La DNA polimerasi ha bisogno di primer per poter sintetizzare un nuovo filamento. La DNA polimerasi è in grado di rilevare appaiamenti non corretti e di rimuovere i nucleotidi errati grazie a un'attività esonucleasica 3'-5', definita anche correttore di bozze (proofreading).
La sintesi di un nuovo filamento di DNA avviene rispettando la complementarietà delle basi azotate rispetto allo stampo e utilizzando deossinucleosidi trifosfato. Mediante esperimenti condotti negli anni '60 è stato scoperto che uno dei due filamenti viene sintetizzato in modo continuo (leading strand, filamento continuo) a partire da un unico primer, l'altro in modo discontinuo (lagging strand, filamento ritardato).
La sintesi del filamento lagging avviene a tratti, producendo dei frammenti di DNA, detti frammenti di Okazaki, lunghi 1000-2000 nucleotidi nei procarioti, 100-200 negli eucarioti. Tutti i primer vengono rimossi nel corso della duplicazione dei due filamenti ad opera dell'enzima RNAasi H e dall'intervento di polimerasi alternative che provvedono inoltre a colmare i vuoti rimasti. La formazione dei legami fosfodiesterici tra i vari frammenti è realizzato dalla DNA ligasi.
Il filamento duplicato in modo continuo è detto leading strand, quello prodotto in modo frammentario è detto lagging strand. La sintesi del filamento lagging richiede che venga ripiegato insieme allo stampo a formare un'ansa che si allunga man mano che la sintesi procede.
In Escherichia coli la polimerasi principalmente coinvolta è la DNA polimerasi III, di cui esistono due copie unite a formare un complesso multiproteico insieme ad altre proteine, saldamente ancorato alla forca di replicazione. Negli eucarioti intervengono, invece, due copie della DNA polimerasi δ, che tuttavia non sono fisicamente unite.
La forma lineare dei cromosomi eucariotici pone dei limiti alla replicazione delle estremità. Il problema riguarda il filamento lagging, dove la rimozione dell'ultimo primer del frammento di Okazaki sintetizzato per ultimo non consente al macchinario replicativo di colmare il gap lasciato, perché dovrebbe agire allungando un terminale 3' di un frammento adiacente. Il risultato sarebbe un filamento lagging più corto che si accorcerebbe ad ogni replicazione potendo causare la perdita di geni essenziali.
Le estremità dei cromosomi, i telomeri, svolgono un ruolo protettivo di fondamentale importanza dei cromosomi e il loro mantenimento deve essere salvaguardato. Essi sono caratterizzati, in una delle due eliche, dalla ripetizione per un centinaio di volte di corte sequenze 5'-TTAGGG-3'. Il mantenimento dei telomeri è assicurato dall'enzima telomerasi, che contiene un RNA ricco in nucleotidi AC in grado di appaiarsi all'estremità del cromosoma ricca in TG, facendone sporgere una parte che la componente proteica dell'enzima allunga sulla base della sequenza dell'RNA, utilizzata quindi come stampo.
L'allungamento della porzione ricca in TG crea un tratto a singolo filamento. È probabile che il filamento complementare venga allungato grazie all'intervento del normale macchinario replicativo. La componente proteica della telomerasi allunga il filamento ricco in TG utilizzando lo stampo di RNA. La telomerasi quindi trasloca consentendo l'allungamento di un altro tratto. Il processo continua per più volte.