Il turnover delle proteine è un processo essenziale per la vita cellulare, che implica la sintesi e la degradazione continua delle proteine all’interno delle cellule. Questo meccanismo dinamico è cruciale per mantenere l’omeostasi cellulare, adattarsi a cambiamenti ambientali e rispondere a stimoli fisiologici.
Il turnover proteico si riferisce al bilancio tra la sintesi e la degradazione delle proteine all’interno di una cellula. Questo equilibrio è fondamentale per la funzione cellulare ottimale e per la risposta adattativa a vari stimoli.
L’importanza del turnover proteico risiede nella sua capacità di rimuovere proteine danneggiate o mal ripiegate, che potrebbero altrimenti accumularsi e causare disfunzioni cellulari. Un turnover proteico efficiente è anche essenziale per il metabolismo energetico. Le proteine degradate possono essere riciclate per la sintesi di nuove proteine o utilizzate come fonte di energia.
Processi Chiave nel Turnover Proteico
Il turnover proteico coinvolge una serie di meccanismi cellulari complessi che orchestrano la sintesi e la degradazione delle proteine. La sintesi proteica è il primo passo del turnover proteico e avviene nei ribosomi, dove l’informazione genetica codificata nel DNA viene tradotta in catene polipeptidiche. La degradazione proteica è altrettanto cruciale e avviene principalmente attraverso due sistemi principali: il sistema ubiquitina-proteasoma e il sistema lisosomiale. Entrambi questi sistemi sono regolati da una serie di segnali cellulari che determinano quali proteine devono essere degradate e quando.
Sintesi Proteica
La sintesi proteica è un processo multi-step che inizia con la trascrizione del DNA in RNA messaggero (mRNA) nel nucleo. L’mRNA viene poi esportato nel citoplasma, dove viene tradotto in proteine dai ribosomi. La regolazione della sintesi proteica è complessa e avviene a vari livelli. A livello della trascrizione, la disponibilità di fattori di trascrizione e la modifica epigenetica del DNA possono influenzare la quantità di mRNA prodotto.
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Gli ormoni e i nutrienti giocano un ruolo cruciale nella regolazione della sintesi proteica. Ad esempio, l’insulina e gli aminoacidi essenziali possono stimolare la sintesi proteica attivando la via di segnalazione mTOR, che promuove la traduzione dell’mRNA. Inoltre, la sintesi proteica è strettamente regolata in risposta a segnali cellulari interni ed esterni, garantendo che le proteine siano prodotte solo quando necessario e in quantità appropriate.
Degradazione Proteica
La degradazione proteica è un processo essenziale che permette la rimozione di proteine danneggiate, mal ripiegate o non necessarie. Il sistema ubiquitina-proteasoma è altamente specifico e coinvolge l’etichettatura delle proteine destinate alla degradazione con una molecola chiamata ubiquitina. Questo processo, noto come ubiquitinazione, segna le proteine per il trasporto al proteasoma, un complesso enzimatico che degrada le proteine in peptidi più piccoli.
Il sistema lisosomiale, d’altra parte, è responsabile della degradazione di proteine di membrana, organelli danneggiati e altre macromolecole. Entrambi questi sistemi sono regolati da una serie di segnali cellulari che determinano quali proteine devono essere degradate e quando.
Il Sistema Ubiquitina-Proteasoma
Uno studio iniziato alla fine degli anni Settanta del Novecento ha dimostrato che una singola via proteolitica estremamente complessa è responsabile delle fasi principali della degradazione selettiva delle proteine cellulari solubili: la via ubiquitina-proteasoma. Sebbene i lisosomi nelle cellule animali e i vacuoli nelle cellule vegetali e nei lieviti siano importanti organuli degradativi, la maggior parte dei fenomeni di demolizione di proteine citoplasmatiche che avviene in essi è relativamente aspecifica. Il contatto con gli enzimi idrolitici all'interno dei lisosomi avviene, infatti, in seguito a processi autofagici, che 'inghiottono' porzioni casuali di citoplasma. Vi sono, ovviamente, molti altri enzimi proteolitici nelle cellule e sono in corso approfonditi studi su alcuni di essi, come le calpaine e le proteasi tipo ICE (Interleukin converting enzyme), cruciali per l'apoptosi.
L'attivazione del gruppo α-carbossilico terminale dell'ubiquitina da parte di E1 è un passaggio obbligatorio in tutti i processi dipendenti dall'ubiquitinilazione. Nello stesso modo in cui l'ubiquitina è indispensabile per la vitalità della cellula, non è stato sorprendente apprendere che E1 è essenziale per l'attività dell'ubiquitina. Vi sono due geni trovati nel lievito che codificano due polipeptidi, piuttosto divergenti, di tipo simile a E1. In presenza di ubiquitina e ATP, l'enzima E1 forma un tioestere con l'ubiquitina. Al contrario, le proteine E2 non formano legami tioestere con l'ubiquitina in assenza di E1. Avram Hershko e collaboratori hanno dimostrato (1983) che l'ubiquitina è trasferita da E1 a E2 mediante transtiolazione.
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Il frazionamento, sia di reticolociti di coniglio sia di estratti di lievito, ha rivelato la presenza di diverse isoforme di E2, codificate da una famiglia di geni correlati tra loro. Nel lievito si possono riconoscere tredici enzimi simili a E2 (chiamati anche Ubc). Mentre i dati genetici del lievito indicano che la presenza di enzimi E2 multipli può essere necessaria per la massima degradazione di un substrato, l'analisi dell'ubiquitinilazione in vitro ha suggerito che diversi enzimi E2 potrebbero, a volte, avere funzioni ridondanti nell'ubiquitinilazione di particolari substrati. Tre differenti enzimi E2, che per sequenza non sembrano appartenere tutti alla stessa sottofamiglia, sono ciascuno in grado di ubiquitinilare la proteina antioncogene p53 in vitro.
Si ritiene generalmente che il componente del sistema di coniugazione dell'ubiquitina più direttamente coinvolto nel riconoscimento del substrato sia l'enzima E3 o ligasi E3. Gli enzimi E3 sono tuttavia i meno conosciuti tra i fattori coinvolti nel legame ubiquitina-proteina, e quelli di cui si è, finora, compreso meno il funzionamento. Innanzitutto, le ligasi E3 possono essere raggruppate in classi distinte, in termini di sequenza amminoacidica e, probabilmente, anche per quanto riguarda il meccanismo d'azione. Negli ultimi anni, la famiglia degli enzimi E3 conosciuti o 'sospetti' ha iniziato a espandersi in maniera significativa. La regione all'estremità carbossiterminale, composta di circa 350 residui amminoacidici, è conservata in almeno una dozzina di questi enzimi, in organismi che vanno dal lievito ai Mammiferi, ed è stata chiamata 'dominio hect' (Homologous to E6-AP carboxyl-terminus). Il dominio hect comprende un residuo di cisteina sempre conservato, che nel caso di E6-AP (uno degli enzimi E3 più caratterizzati) è essenziale per la formazione del tioestere-ubiquitina e per l'ubiquitinilazione del substrato. È stato dimostrato che anche altre proteine di questa classe formano tioesteri con l'ubiquitina e sono implicate nell'ubiquitinilazione di proteine specifiche.
Mentre è ormai chiaro che per ubiquitinilare le proteine substrato sono necessari molti enzimi differenti, rimane ancora da chiarire come il substrato sia riconosciuto con precisione e come venga multiubiquitinilato. Potrebbe essere più appropriato considerare come fattore di riconoscimento l'intero complesso di ubiquitinilazione, che comprende le proteine tipo E2 ed E3 (e forse anche E1), piuttosto che le sole proteine E3. Il complesso di ubiquitinilazione potrebbe assemblare una o più catene di ubiquitina direttamente sul substrato, mediante ripetute aggiunte di singole molecole di ubiquitina, oppure trasferendo una catena preassemblata sulla proteina bersaglio.
Cosa distingue una proteina substrato per l'ubiquitinilazione da proteine che vengono raramente ubiquitinilate o che non lo sono mai? Questo è un quesito fondamentale, benché in gran parte irrisolto. Gli esperimenti in corso stanno chiarendo che i substrati del sistema di degradazione mediato dall'ubiquitina contengono degli elementi di sequenza o 'segnali' che li indirizzano verso un rapido turnover e che questi segnali differiscono da substrato a substrato. L'analisi di substrati modello artificiali ha rivelato che alcuni segnali di degradazione contengono elementi separabili: uno che funziona come sito di legame per un fattore che riconosce il substrato e l'altro che serve da sito di legame per l'ubiquitina. L'ubiquitina viene quindi attaccata a residui di lisina, ma qual è l'elemento di riconoscimento che rende una lisina ubiquitinilabile? Sono in corso di definizione siti putativi di riconoscimento da parte degli enzimi ubiquitinilanti. Il primo esempio è stato la regione amminoterminale di substrati proteici artificiali.
La regolazione della degradazione ubiquitina-dipendente è di grande interesse. Molte cicline di tipo B sono degradate solo durante la mitosi e, almeno nel lievito, nella fase precoce G1 del ciclo cellulare. Una sequenza moderatamente conservata di nove residui, posta all'estremità amminoterminale, costituisce il segnale di degradazione, il cosiddetto 'dominio di distruzione'. È probabile che esistano dei controlli addizionali anche a livello del substrato stesso. Questo è suggerito dal fatto che la degradazione delle cicline di tipo A dipende dal dominio di distruzione, ma mostra nello stesso tempo una diversa dipendenza dal ciclo cellulare rispetto a quella delle cicline B.
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La poliubiquitinilazione del substrato proteolitico, di solito per aggiunta di uno o più oligomeri di ubiquitina, sembra stimolare la proteolisi anche se, almeno in vitro, la monoubiquitinilazione è chiaramente sufficiente per avere velocità apprezzabili di degradazione proteasomiale di alcune proteine. D'altra parte, alcune proteine dipendono chiaramente dalla poliubiquitinilazione per avere un rapido turnover in vitro. Sebbene non vi siano molti dati disponibili a questo riguardo, è stato anche suggerito che l'ubiquitina potrebbe innescare la denaturazione del substrato piuttosto che essere semplicemente un segnale passivo per il proteasoma. È probabile che le condizioni richieste per la denaturazione dipendente dall'ubiquitina siano variabili da substrato a substrato. L'ubiquitina potrebbe anche facilitare la denaturazione del substrato in maniera indiretta. Si ritiene che complessi regolatori (19S) all'interno del proteasoma 26S denaturino i substrati, forse mediante l'azione delle sei o più subunità ATPasiche trovate nel complesso, allo scopo di far penetrare la proteina all'interno del proteasoma 20S vero e proprio. Le catene di ubiquitina attaccate al substrato potrebbero servire da ancore per il proteasoma, per cui le proteine difficili da denaturare dovrebbero richiedere un'ubiquitinilazione maggiore.
Molecole di ubiquitina sono, generalmente, legate insieme tramite legami isopeptidici tra una lisina in posizione 48 di un'ubiquitina e il gruppo carbossiterminale dell'altra ubiquitina. Recenti studi molecolari e genetici suggeriscono che si possano formare anche altri tipi di legame che coinvolgono, forse, forme varianti di ubiquitina.
L'ubiquitina è rimossa dai substrati a opera di enzimi noti come 'enzimi deubiquitinilanti': idrolasi carbossiterminale dell'ubiquitina oppure isopeptidasi dell'ubiquitina. Questi enzimi appartengono a due distinte famiglie: un gruppo di proteine relativamente piccole, che potrebbero rimuovere preferenzialmente l'ubiquitina da peptidi e da piccoli addotti, e un gruppo di proteine più grandi, che generalmente rimuovono l'ubiquitina da una gamma di substrati proteici, almeno in vitro. Quest'ultima famiglia, la cosiddetta 'classe Ubp' (Ubiquitinspecific processing protease), è estremamente diversificata, ma tutti i membri contengono differenti sequenze di consenso brevi, i 'domini Cys e His', che probabilmente aiutano a formare il sito attivo dell'enzima.
Cambiare la velocità di deubiquitinilazione del substrato vuol dire alterare la probabilità che un intermedio poliubiquitinilato venga riconosciuto dal proteasoma 26S. Il numero sorprendentemente alto di enzimi deubiquitinilanti che si sta via via scoprendo aumenta la probabilità che la velocità del turnover di una specifica proteina possa essere regolata da questi enzimi in modo differenziale. Mentre è ragionevole supporre che, per la maggior parte, gli enzimi deubiquitinilanti lavorino come regolatori negativi del sistema dell'ubiquitina, vi sono anche modalità in cui gli enzimi deubiquitinilanti potrebbero aumentare l'ubiquitinilazione delle proteine o la loro degradazione. Prima di tutto, l'ubiquitina è sempre sintetizzata sotto forma di precursore e richiede la rimozione di peptidi o amminoacidi all'estremità carbossiterminale. Gli enzimi deubiquitinilanti sono, quindi, necessari per generare monomeri di ubiquitina. In secondo luogo, l'ubiquitina attivata può velocemente formare addotti con nucleofili cellulari particolarmente abbondanti come, per esempio, le ammine o il glutatione. Si stanno acquisendo prove sui diversi enzimi deubiquitinilanti che indicano che, in vivo, il loro ruolo sia effettivamente quello di facilitare la degradazione ubiquitina-dipendente, impedendo l'eccessivo accumulo di oligomeri inibitori di ubiquitina.
Altri dati, che dimostrano che gli enzimi deubiquitinilanti possono avere una funzione di regolazione, derivano da lavori recenti condotti su cellule di mammifero. È stato osservato che diverse proteine implicate nella genesi dei tumori o nel controllo della crescita sono enzimi deubiquitinilanti. È interessante inoltre considerare che, per quanto riguarda l'oncogene umano tre-2, sembra che il prodotto proteico responsabile dell'attività tumorigenica sia la forma inattiva di un enzima deubiquitinilante.
Il Proteasoma 26S
Il proteasoma 26S è un grosso complesso multimerico, composto da un core proteolitico, noto come 'proteasoma 20S', e da un paio di complessi regolatori 19S, disposti simmetricamente. Questi ultimi complessi sono strettamente imparentati con una proteina nota come PA700 (Proteasome activator di 700 kDa), anche se la loro esatta composizione e funzione e la loro precisa relazione con PA700 devono essere ancora chiarite. Quattro anelli, ciascuno composto da sette subunità, sono impilati in un cilindro a formare il proteasoma 20S. Queste subunità sono codificate da una famiglia di geni correlati ma distinti.
La struttura del proteasoma 20S di Thermoplasma acidophilum, rivelata con risoluzione di 0,34 nm, ha permesso di far luce sul suo meccanismo d'azione. Dall'analisi della struttura del co-cristallo del proteasoma con un peptide inibitore, è stato possibile localizzare il sito attivo all'interno delle subunità β sulla superficie interna di una camera centrale del complesso del proteasoma. Le pareti del cilindro mostrano di non possedere larghe aperture, limitando così l'ingresso e l'uscita dei substrati e dei prodotti a una serie di canali che danno accesso alle due estremità del cilindro.
Il riconoscimento di questi gruppi catalitici nella struttura tridimensionale del proteasoma ha rivelato un'altra sorpresa: l'attività catalitica del proteasoma è basata sulla presenza di un residuo dell'amminoacido treonina nel sito attivo; quindi, il proteasoma è una proteasi a treonina, la prima descritta finora. Una distinzione significativa tra il proteasoma di T. acidophilum e il proteasoma 20S degli eucarioti è che l'enzima procariotico ha un singolo sito attivo, mentre il più complesso proteasoma eucariotico ne ha almeno tre. Non è immediatamente comprensibile perché il proteasoma eucariotico 20S debba avere tante distinte subunità né è evidente quale sia la loro relazione con i diversi tipi di siti catalitici. Tuttavia, dato che il proteasoma 20S eucariotico deve associarsi con molti tipi distinti di fattori di regolazione alle due estremità del cilindro proteasomico, si può supporre che un'ulteriore variabilità nelle subunità α possa portare a un più ampio spettro di capacità di legame di fattori di regolazione. La presenza di molteplici subunità β, d'altro canto, potrebbe permettere sia una fine regolazione delle specificità di taglio di proteine (cleavage), sia una più efficiente degradazione di uno spettro più ampio di substrati.
A differenza del proteasoma 26S, il proteasoma 20S non è capace di degradare proteine che siano in una conformazione tridimensionale stabile, ma può frammentarle completamente, in assenza di ATP, se sono preventivamente denaturate. Pertanto una possibile funzione della particella 19S è quella di denaturare le proteine.
Fattori che Influenzano il Turnover Proteico
Diversi fattori possono influenzare il turnover proteico, tra cui fattori genetici, ambientali e nutrizionali. I fattori ambientali, come la temperatura, il pH e la presenza di tossine, possono anche influenzare il turnover proteico. La dieta e la nutrizione sono altri importanti fattori che influenzano il turnover proteico. La disponibilità di aminoacidi essenziali è cruciale per la sintesi proteica, mentre la carenza di nutrienti può inibire la sintesi e aumentare la degradazione delle proteine.
L’attività fisica è un altro fattore che può influenzare il turnover proteico. L’esercizio fisico aumenta la sintesi proteica nei muscoli, promuovendo la crescita e la riparazione muscolare.
Implicazioni Cliniche
Il turnover proteico ha importanti implicazioni cliniche in una serie di condizioni patologiche. Anche il cancro è strettamente legato al turnover proteico. Le cellule tumorali spesso presentano alterazioni nei meccanismi di sintesi e degradazione delle proteine, che contribuiscono alla loro crescita incontrollata e alla resistenza ai trattamenti. Le malattie metaboliche, come il diabete e l’obesità, sono anch’esse influenzate dal turnover proteico.
Infine, il turnover proteico è cruciale per la rigenerazione tissutale e la guarigione delle ferite.
Nota sugli Amminoacidi Essenziali e la Qualità delle Proteine
Il termine essenziali sta ad indicare l'incapacità dell'organismo di sintetizzare questi aminoacidi a partire da altri aminoacidi tramite trasformazioni biochimiche. Gli alimenti di origine animale hanno il profilo amminoacidico migliore perché generalmente presentano tutti gli aminoacidi essenziali in buone quantità e nel rapporto più simile alle proteine umane. Il criterio usato per valutare la "qualità" delle proteine è detto Valore Biologico. A differenza di questi, gli alimenti di origine vegetale presentano solitamente carenze di uno o più aminoacidi essenziali. Tuttavia queste mancanze possono essere superate attraverso giuste alternanze alimentari, ad esempio cereali e leguminose - un tempo si credeva che fosse necessario associarli nello stesso pasto; oggi sappiamo che è sufficiente alternarli con regolarità.
N.B. Ossidando un grammo di proteine si sviluppa un calore medio di 5,65 kcal. Normalmente viene assorbito il 92 % delle proteine introdotte con la dieta (il 97 % di quelle animali ed il 78 % di quelle vegetali). Le proteine hanno in particolari condizioni anche funzione energetica, ma in un'alimentazione bilanciata questo ruolo è secondario. I nutrizionisti consigliano ai soggetti adulti sedentari di assumere una quantità di proteine pari a 0,8-1,2 g di proteine per kg di peso corporeo fisiologico. In adolescenza sono indispensabili 1,5 g / kg. Le gravide richiedono poco più del normale. Per gli atleti di forza, questa raccomandazione può raggiungere il doppio - mentre gli sportivi di endurance hanno un fabbisogno vicino (o poco superiore) al limite massimo per le persone comuni. Esistono casi particolari, come il malassorbimento cronico in terza età, nei quali può essere necessario aumentare la dose normale. Queste proteine dovrebbero derivare per i 2/3 da prodotti di origine animale e per 1/3 da prodotti di origine vegetale.