Le cellule spesso passano da uno stato all'altro, sia in risposta a stimoli ambientali sia come parte di una via di sviluppo finemente regolata. Questi passaggi richiedono, generalmente, che venga rapidamente smantellata la rete di regolazione preesistente, e ciò dipende, nella maggior parte dei casi, dalla degradazione delle proteine. Tale processo deve essere altamente specifico, allo scopo di evitare che siano coinvolte proteine essenziali o che la degradazione avvenga in tempi inappropriati.
Il turnover proteico selettivo offre numerosi vantaggi rispetto ad altri tipi di meccanismi di regolazione. Un primo vantaggio è la velocità: minore è l'emivita di una proteina, inferiore è il tempo necessario per raggiungere lo stato stazionario in seguito a cambiamenti nella sua velocità di sintesi. Queste caratteristiche aiutano a spiegare perché la degradazione selettiva delle proteine sia quasi sempre una componente dei meccanismi di regolazione che coinvolgono precisi controlli temporali. Alcuni esempi sono la progressione del ciclo cellulare, i ritmi circadiani e le varie vie di trasduzione del segnale che conducono alla specificazione del tipo cellulare, al controllo metabolico e all'embriogenesi.
Uno studio iniziato alla fine degli anni Settanta del Novecento ha dimostrato che una singola via proteolitica estremamente complessa è responsabile delle fasi principali della degradazione selettiva delle proteine cellulari solubili: la via ubiquitina-proteasoma. Sebbene i lisosomi nelle cellule animali e i vacuoli nelle cellule vegetali e nei lieviti siano importanti organuli degradativi, la maggior parte dei fenomeni di demolizione di proteine citoplasmatiche che avviene in essi è relativamente aspecifica. Il contatto con gli enzimi idrolitici all'interno dei lisosomi avviene, infatti, in seguito a processi autofagici, che 'inghiottono' porzioni casuali di citoplasma.
Vi sono, ovviamente, molti altri enzimi proteolitici nelle cellule e sono in corso approfonditi studi su alcuni di essi, come le calpaine e le proteasi tipo ICE (Interleukin converting enzyme), cruciali per l'apoptosi.
Il Ruolo dell'Ubiquitina
L'Ubiquitina è una molecola fondamentale per la sopravvivenza di tutti gli organismi eucarioti. La sua importanza è tale da essere presente in tutte le cellule dell'organismo e di essere estremamente conservata. Questa affermazione sta a significare che la struttura dell'Ubiquitina è praticamente identica in ogni organismo eucariote.
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L'ubiquitina è formata da una catena di 76 amminoacidi di natura termostabile la cui struttura terziaria evidenzia la presenza di 1 elica alfa e 4 filamenti beta. Il ripiegamento tridimensionale è tale da lasciare in evidenza, esposti esternamente, dei residui di Lisina posti in posizione mediana lungo la catena. Questi residui sono fondamentali perché partecipano al legame isopeptidico tra varie molecole di Ubiquitina.
Il legame isopeptidico si genera per unione tra il gruppo amminico della Lisina laterale di una delle due molecole e quello carbossilico della Glicina terminale dell'altra. Questo legame è un legame peptidico anomalo, perché coinvolge un gruppo amminico di catena laterale anziché terminale, come avviene di solito. La formazione di questo tipo di legame richiede idrolisi di ATP.
La funzione principale dell'Ubiquitina è di segnalare le proteine destinate alla degradazione. Tale destino è riservato alle proteine danneggiate, a quelle vecchie (per il normale turn over proteico della cellula) e a quelle proteine la cui vita è fisiologicamente molto breve, come le cicline e le proteine di regolazione dell'espressione genica, la cui presenza è funzionale ad una specifica e circoscritta necessità fisiologica della cellula.
Quando una proteina, per le ragioni summenzionate, è destinata ad essere distrutta, viene “segnata” attraverso il legame con una catena di almeno 4 molecole di Ubiquitina.
Gli Enzimi Coinvolti: E1, E2, E3
Il processo di formazione di questo legame coinvolge tre enzimi:
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- Enzima E1: questo enzima lega la coda dell'Ubiquitina determinandone l'attivazione. L'attivazione del gruppo α-carbossilico terminale dell'ubiquitina da parte di E1 è un passaggio obbligatorio in tutti i processi dipendenti dall'ubiquitinilazione. Nello stesso modo in cui l'ubiquitina è indispensabile per la vitalità della cellula, non è stato sorprendente apprendere che E1 è essenziale per l'attività dell'ubiquitina. Vi sono due geni trovati nel lievito che codificano due polipeptidi, piuttosto divergenti, di tipo simile a E1. In presenza di ubiquitina e ATP, l'enzima E1 forma un tioestere con l'ubiquitina.
- Enzima E2: Al contrario, le proteine E2 non formano legami tioestere con l'ubiquitina in assenza di E1. Avram Hershko e collaboratori hanno dimostrato (1983) che l'ubiquitina è trasferita da E1 a E2 mediante transtiolazione. Il frazionamento, sia di reticolociti di coniglio sia di estratti di lievito, ha rivelato la presenza di diverse isoforme di E2, codificate da una famiglia di geni correlati tra loro. Nel lievito si possono riconoscere tredici enzimi simili a E2 (chiamati anche Ubc). Mentre i dati genetici del lievito indicano che la presenza di enzimi E2 multipli può essere necessaria per la massima degradazione di un substrato, l'analisi dell'ubiquitinilazione in vitro ha suggerito che diversi enzimi E2 potrebbero, a volte, avere funzioni ridondanti nell'ubiquitinilazione di particolari substrati. Tre differenti enzimi E2, che per sequenza non sembrano appartenere tutti alla stessa sottofamiglia, sono ciascuno in grado di ubiquitinilare la proteina antioncogene p53 in vitro.
- Enzima E3: A questo punto entra in gioco l'enzima E3, che ha una forma a tenaglia e riesce a legare da una estremità la proteina da degradare e dall'altra l'Ubiquitina attivata e coniugata. Si ritiene generalmente che il componente del sistema di coniugazione dell'ubiquitina più direttamente coinvolto nel riconoscimento del substrato sia l'enzima E3 o ligasi E3. Gli enzimi E3 sono tuttavia i meno conosciuti tra i fattori coinvolti nel legame ubiquitina-proteina, e quelli di cui si è, finora, compreso meno il funzionamento. Innanzitutto, le ligasi E3 possono essere raggruppate in classi distinte, in termini di sequenza amminoacidica e, probabilmente, anche per quanto riguarda il meccanismo d'azione. Negli ultimi anni, la famiglia degli enzimi E3 conosciuti o 'sospetti' ha iniziato a espandersi in maniera significativa. La regione all'estremità carbossiterminale, composta di circa 350 residui amminoacidici, è conservata in almeno una dozzina di questi enzimi, in organismi che vanno dal lievito ai Mammiferi, ed è stata chiamata 'dominio hect' (Homologous to E6-AP carboxyl-terminus). Il dominio hect comprende un residuo di cisteina sempre conservato, che nel caso di E6-AP (uno degli enzimi E3 più caratterizzati) è essenziale per la formazione del tioestere-ubiquitina e per l'ubiquitinilazione del substrato. È stato dimostrato che anche altre proteine di questa classe formano tioesteri con l'ubiquitina e sono implicate nell'ubiquitinilazione di proteine specifiche.
Quando l'Ubiquitina e la proteina bersaglio sono tenute vicine dal legame con la tenaglia E3, l'enzima Ubiquitina-Proteina-Ligasi catalizza la sintesi del legame tra le due.
La presenza di almeno quattro molecole di Ubiquitina legate tra loro consente al complesso di essere attaccato dal proteasoma che compirà la degradazione della proteina. Le molecole di Ubiquitina che rimangono intatte vengono rimosse grazie all'azione di specifici enzimi e riciclate dal sistema cellula.
Le molecole di Ubiquitina sono prodotte per trascrizione e traduzione di sequenze geniche che non sono mai isolate: in alcuni casi esse sono associate a sequenze codificanti per altre proteine e sono trascritte insieme in un unico di mRNA. In altri casi, i geni codificanti per l'Ubiquitina non sono associati a geni relativi ad altre proteine ma piuttosto sono organizzati in ripetizioni sequenziali di geni uguali, cosicché il trascritto produrrà delle catene lineari di poliubiquitina.
Il Proteasoma e la Degradazione Proteica
Come fa l'Ubiquitina a determinare la degradazione delle proteine? Sebbene alcune proteine molto piccole possano essere degradate anche senza l'ausilio dell'Ubiquitina, nella stragrande maggioranza dei casi la poliubiquitinizzazione (cioè il legame con più molecole di Ubiquitina) è necessario per portare una proteina alla sua demolizione.
Come abbiamo già detto, la molecola responsabile in solido della degradazione delle proteine è il complesso del proteasoma, i cui siti attivi consentono la distruzione della catena amminoacidica della proteina stessa. Quasi tutte le proteine possiedono una intrinseca affinità con il proteasoma, che ne determina il legame casuale all'interno dell'ambiente cellulare. In presenza di una poliubiquitinizzazione, invece, il legame si stabilizza ed il proteasoma riesce a compiere il processo di degradazione per cui è programmato.
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Meno noti sono invece i meccanismi che consentono all'Ubiquitina di identificare le proteine destinate alla distruzione e discriminarle da quelle ancora necessarie al funzionamento cellulare. L'efficacia di questo sistema di comunicazione si basa su un preciso linguaggio molecolare, codificato da modificazioni chimiche apportate in maniera reversibile alle proteine cellulari. Questa comunicazione è mediata da fattori di crescita, nutrienti o altro e si trasmette all'interno della cellula grazie all' endocitosi e traffico intracellulare.
Per decifrare il codice dell'ubiquitina il team diretto da Polo oltre a diversi approcci classici di biologia cellulare e molecolare e di biochimica.
I processi cellulari regolati attraverso l'ubiquitinazione sono numerosi e toccano potenzialmente tutti gli aspetti della vita di una cellula. Emblematico è, ad esempio, il caso di BRCA1, una proteina che interviene nella risposta di danno al DNA la cui funzione è trasferire molecola di ubiquitina al suo bersaglio.
È interessante l'esempio delle cicline, proteine di regolazione che svolgono un ruolo fondamentale nella progressione del ciclo cellulare. L'improvvisa scomparsa di alcune cicline in momenti precisi del ciclo è alla base di questa progressione. La loro rapida rimozione è garantita dall'ubiquitinilazione seguita da proteolisi nel proteasoma. Le cicline mitotiche possono essere ubiquitinilate, in vitro, da due diversi enzimi E2: Ubc4 o UBCx/E2-C.
Cosa distingue una proteina substrato per l'ubiquitinilazione da proteine che vengono raramente ubiquitinilate o che non lo sono mai? Questo è un quesito fondamentale, benché in gran parte irrisolto. Gli esperimenti in corso stanno chiarendo che i substrati del sistema di degradazione mediato dall'ubiquitina contengono degli elementi di sequenza o 'segnali' che li indirizzano verso un rapido turnover e che questi segnali differiscono da substrato a substrato. L'analisi di substrati modello artificiali ha rivelato che alcuni segnali di degradazione contengono elementi separabili: uno che funziona come sito di legame per un fattore che riconosce il substrato e l'altro che serve da sito di legame per l'ubiquitina. L'ubiquitina viene quindi attaccata a residui di lisina, ma qual è l'elemento di riconoscimento che rende una lisina ubiquitinilabile? Sono in corso di definizione siti putativi di riconoscimento da parte degli enzimi ubiquitinilanti. Il primo esempio è stato la regione amminoterminale di substrati proteici artificiali.
La regolazione della degradazione ubiquitina-dipendente è di grande interesse. Vediamo, per esempio, cosa accade nelle cicline alle quali abbiamo già accennato. Molte cicline di tipo B sono degradate solo durante la mitosi e, almeno nel lievito, nella fase precoce G1 del ciclo cellulare. Una sequenza moderatamente conservata di nove residui, posta all'estremità amminoterminale, costituisce il segnale di degradazione, il cosiddetto 'dominio di distruzione'. È probabile che esistano dei controlli addizionali anche a livello del substrato stesso. Questo è suggerito dal fatto che la degradazione delle cicline di tipo A dipende dal dominio di distruzione, ma mostra nello stesso tempo una diversa dipendenza dal ciclo cellulare rispetto a quella delle cicline B.
Poliubiquitinilazione e Denaturazione
La poliubiquitinilazione del substrato proteolitico, di solito per aggiunta di uno o più oligomeri di ubiquitina, sembra stimolare la proteolisi anche se, almeno in vitro, la monoubiquitinilazione è chiaramente sufficiente per avere velocità apprezzabili di degradazione proteasomiale di alcune proteine. D'altra parte, alcune proteine dipendono chiaramente dalla poliubiquitinilazione per avere un rapido turnover in vitro.
Sebbene non vi siano molti dati disponibili a questo riguardo, è stato anche suggerito che l'ubiquitina potrebbe innescare la denaturazione del substrato piuttosto che essere semplicemente un segnale passivo per il proteasoma. È probabile che le condizioni richieste per la denaturazione dipendente dall'ubiquitina siano variabili da substrato a substrato.
L'ubiquitina potrebbe anche facilitare la denaturazione del substrato in maniera indiretta. Si ritiene che complessi regolatori (19S) all'interno del proteasoma 26S denaturino i substrati, forse mediante l'azione delle sei o più subunità ATPasiche trovate nel complesso, allo scopo di far penetrare la proteina all'interno del proteasoma 20S vero e proprio. Le catene di ubiquitina attaccate al substrato potrebbero servire da ancore per il proteasoma, per cui le proteine difficili da denaturare dovrebbero richiedere un'ubiquitinilazione maggiore.
Molecole di ubiquitina sono, generalmente, legate insieme tramite legami isopeptidici tra una lisina in posizione 48 di un'ubiquitina e il gruppo carbossiterminale dell'altra ubiquitina. Recenti studi molecolari e genetici suggeriscono che si possano formare anche altri tipi di legame che coinvolgono, forse, forme varianti di ubiquitina.
Enzimi Deubiquitinilanti
L'ubiquitina è rimossa dai substrati a opera di enzimi noti come 'enzimi deubiquitinilanti': idrolasi carbossiterminale dell'ubiquitina oppure isopeptidasi dell'ubiquitina. Questi enzimi appartengono a due distinte famiglie: un gruppo di proteine relativamente piccole, che potrebbero rimuovere preferenzialmente l'ubiquitina da peptidi e da piccoli addotti, e un gruppo di proteine più grandi, che generalmente rimuovono l'ubiquitina da una gamma di substrati proteici, almeno in vitro. Quest'ultima famiglia, la cosiddetta 'classe Ubp' (Ubiquitinspecific processing protease), è estremamente diversificata, ma tutti i membri contengono differenti sequenze di consenso brevi, i 'domini Cys e His', che probabilmente aiutano a formare il sito attivo dell'enzima.
Cambiare la velocità di deubiquitinilazione del substrato vuol dire alterare la probabilità che un intermedio poliubiquitinilato venga riconosciuto dal proteasoma 26S. Il numero sorprendentemente alto di enzimi deubiquitinilanti che si sta via via scoprendo aumenta la probabilità che la velocità del turnover di una specifica proteina possa essere regolata da questi enzimi in modo differenziale.
Mentre è ragionevole supporre che, per la maggior parte, gli enzimi deubiquitinilanti lavorino come regolatori negativi del sistema dell'ubiquitina, vi sono anche modalità in cui gli enzimi deubiquitinilanti potrebbero aumentare l'ubiquitinilazione delle proteine o la loro degradazione. Prima di tutto, l'ubiquitina è sempre sintetizzata sotto forma di precursore e richiede la rimozione di peptidi o amminoacidi all'estremità carbossiterminale. Gli enzimi deubiquitinilanti sono, quindi, necessari per generare monomeri di ubiquitina.
In secondo luogo, l'ubiquitina attivata può velocemente formare addotti con nucleofili cellulari particolarmente abbondanti come, per esempio, le ammine o il glutatione. Si stanno acquisendo prove sui diversi enzimi deubiquitinilanti che indicano che, in vivo, il loro ruolo sia effettivamente quello di facilitare la degradazione ubiquitina-dipendente, impedendo l'eccessivo accumulo di oligomeri inibitori di ubiquitina.
Altri dati, che dimostrano che gli enzimi deubiquitinilanti possono avere una funzione di regolazione, derivano da lavori recenti condotti su cellule di mammifero. È stato osservato che diverse proteine implicate nella genesi dei tumori o nel controllo della crescita sono enzimi deubiquitinilanti. È interessante inoltre considerare che, per quanto riguarda l'oncogene umano tre-2, sembra che il prodotto proteico responsabile dell'attività tumorigenica sia la forma inattiva di un enzima deubiquitinilante.
Il Proteasoma 26S
Il proteasoma 26S è un grosso complesso multimerico, composto da un core proteolitico, noto come 'proteasoma 20S', e da un paio di complessi regolatori 19S, disposti simmetricamente. Questi ultimi complessi sono strettamente imparentati con una proteina nota come PA700 (Proteasome activator di 700 kDa), anche se la loro esatta composizione e funzione e la loro precisa relazione con PA700 devono essere ancora chiarite.
Quattro anelli, ciascuno composto da sette subunità, sono impilati in un cilindro a formare il proteasoma 20S. Queste subunità sono codificate da una famiglia di geni correlati ma distinti. La struttura del proteasoma 20S di Thermoplasma acidophilum, rivelata con risoluzione di 0,34 nm, ha permesso di far luce sul suo meccanismo d'azione.
Dall'analisi della struttura del co-cristallo del proteasoma con un peptide inibitore, è stato possibile localizzare il sito attivo all'interno delle subunità β sulla superficie interna di una camera centrale del complesso del proteasoma. Le pareti del cilindro mostrano di non possedere larghe aperture, limitando così l'ingresso e l'uscita dei substrati e dei prodotti a una serie di canali che danno accesso alle due estremità del cilindro.
Il riconoscimento di questi gruppi catalitici nella struttura tridimensionale del proteasoma ha rivelato un'altra sorpresa: l'attività catalitica del proteasoma è basata sulla presenza di un residuo dell'amminoacido treonina nel sito attivo; quindi, il proteasoma è una proteasi a treonina, la prima descritta finora.
Una distinzione significativa tra il proteasoma di T. acidophilum e il proteasoma 20S degli eucarioti è che l'enzima procariotico ha un singolo sito attivo, mentre il più complesso proteasoma eucariotico ne ha almeno tre. Non è immediatamente comprensibile perché il proteasoma eucariotico 20S debba avere tante distinte subunità né è evidente quale sia la loro relazione con i diversi tipi di siti catalitici. Tuttavia, dato che il proteasoma 20S eucariotico deve associarsi con molti tipi distinti di fattori di regolazione alle due estremità del cilindro proteasomico, si può supporre che un'ulteriore variabilità nelle subunità α possa portare a un più ampio spettro di capacità di legame di fattori di regolazione.
La presenza di molteplici subunità β, d'altro canto, potrebbe permettere sia una fine regolazione delle specificità di taglio di proteine (cleavage), sia una più efficiente degradazione di uno spettro più ampio di substrati.
A differenza del proteasoma 26S, il proteasoma 20S non è capace di degradare proteine che siano in una conformazione tridimensionale stabile, ma può frammentarle completamente, in assenza di ATP, se sono preventivamente denaturate. Pertanto una possibile funzione della particella 1...
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