La cromatografia a scambio ionico è una tecnica fondamentale per separare le molecole, in particolare le proteine, in base alla loro carica superficiale netta.
Principi di Base
Le proteine sono macromolecole biologiche composte da amminoacidi contenenti gruppi sia basici che acidi. La loro carica di superficie netta varia significativamente in base al pH del microambiente in cui si trovano. Esiste una specifica relazione tra la carica della proteina e il pH, descritta da una curva di titolazione. Questa relazione è unica per ciascun tipo di proteina, ed è proprio su questa base che è possibile separarla dalle altre utilizzando la cromatografia a scambio ionico.
Tipi di Cromatografia a Scambio Ionico
Esistono due tipologie principali di cromatografia a scambio ionico: a scambio cationico e anionico. Per comprenderne la differenza, è necessario introdurre il concetto di punto isoelettrico (pI).
- Punto Isoelettrico (pI): Il valore di pH al quale una proteina non possiede una carica di superficie netta è detto punto isoelettrico (pI).
- Scambio Cationico: Se il pH è inferiore al pI, la proteina sarà carica positivamente e si legherà al materiale della colonna carico negativamente.
- Scambio Anionico: Se il pH è superiore al pI, la proteina sarà carica negativamente e si legherà al materiale della colonna carico positivamente.
Procedura di Purificazione
Il processo di purificazione tramite cromatografia a scambio ionico prevede diverse fasi chiave:
- Equilibrazione della Colonna: La colonna viene equilibrata con un buffer a bassa forza ionica e pH prestabilito. La colonna contiene una resina formata da particelle sferiche sostituite con gruppi ionici (positivi o negativi). La resina è porosa per massimizzare la superficie interna di legame.
- Caricamento del Campione: Il campione viene caricato sulla colonna in un buffer con la stessa forza ionica e pH dello start buffer. Durante questa fase, la proteina di interesse si lega alla colonna, mentre le proteine prive di carica o con la stessa carica della resina passano attraverso.
- Lavaggio della Colonna: La colonna viene lavata con lo start buffer per rimuovere le proteine non legate.
- Eluizione: L'eluizione viene effettuata utilizzando un buffer con lo stesso pH dello start buffer ma a maggiore forza ionica. Questo determina una competizione tra gli ioni del buffer e la proteina di interesse per il legame alla colonna.
Controllo dell'Eluizione
È possibile utilizzare diversi gradienti di concentrazione ionica per controllare l'eluizione della proteina, ottimizzando la separazione.
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La forza ionica e il pH dello start buffer sono importanti per minimizzare le interazioni aspecifiche e favorire solo quelle con la proteina di interesse durante il caricamento del campione.
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