Determinazione delle Proteine: Metodi e Analisi

L'analisi delle proteine è essenziale per determinare la qualità del prodotto e le sue prestazioni. Un'interpretazione adeguata è fondamentale per il rilevamento delle frodi. Nel campo sportivo, le proteine svolgono un ruolo molto importante negli adattamenti muscolari all’esercizio.

Importanza delle Proteine e dell'Analisi

Assicurare un buon apporto di proteine nella dieta è fondamentale da un punto di vista della salute. Idealmente, le proteine dovrebbero provenire dal cibo, ma è innegabile che la proteina in polvere sia un prodotto di altissima qualità nutritiva che facilita il consumo di questo nutriente in situazioni di inappetenza o difficoltà di masticazione. Il problema appare quando alcune aziende di integratori non giocano in modo corretto e fingono di vendere un prodotto di qualità.

Perché Realizzare l’Analisi delle Proteine?

• Stabilire il valore di mercato dei prodotti proteici.
• Valutare la qualità degli ingredienti a base di proteine.
• Notificare la conformità degli ingredienti sia per il consumatore che per il venditore, nonché per gli aspetti normativi.
• Determinare l’autenticità degli alimenti e degli ingredienti proteici.
• Analizzare il contenuto nutrizionale degli alimenti per l’etichettatura.

Strategie per Rilevare le Frodi Alimentari

Esistono due approcci principali per identificare potenziali frodi nell’industria alimentare:

1. Analisi delle sostanze adulteranti: In questo caso, il risultato positivo sarebbe l’assenza di un materiale specifico. Il problema con questo approccio è che queste sostanze devono essere conosciute in anticipo.
2. Analisi della purezza degli ingredienti: Questa strategia è efficace quando l’adulterante viene aggiunto in quantità sufficientemente elevate da rilevare una mancanza di purezza del materiale originale.

Fondamenti delle Analisi delle Proteine

Sebbene esistano numerose tecniche per analizzare il contenuto proteico dei prodotti alimentari, ci concentreremo sulla spiegazione delle analisi che possono essere più frequenti nel contesto degli integratori sportivi.

Informazioni sulle proteine nell’etichettatura

Normalmente, possiamo trovare 3 tipi di informazioni riguardanti le proteine sull’etichettatura di un prodotto o integratore:

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• Fonte o fonti da cui provengono queste proteine: indicate nella lista degli ingredienti.
• Quantità di proteine: è indicata nella tabella nutrizionale.
• Profilo amminoacidico della proteina: Aminogramma.

L’obiettivo dell’analisi di laboratorio sarà quindi determinare la quantità di proteine e amminoacidi in una data fonte di cibo. A tal fine, i metodi più comuni si basano sulla determinazione del contenuto di azoto totale e sull’estrapolazione di questi dati alla quantità di proteine totali, attraverso l’uso di determinati fattori di conversione. Cioè, sono metodi indiretti.

"Amino Spiking"

Questo è il motivo principale per cui questi metodi di rilevamento dell’azoto totale non sono affidabili per rilevare frodi. Una delle truffe più comuni è “l’amino spiking”, che passa inosservato in queste tecniche. In modo semplificato, l’amino spiking consiste nell’aggiungere uno o più aminoacidi economici (gli amminoacidi contengono azoto) a una base proteica a bassa purezza. Quando viene determinato l’azoto totale, il risultato offrirebbe la somma dell’azoto della proteina con l’azoto degli amminoacidi e creerebbe una falsa idea che il contenuto proteico sia elevato.

Metodi di Rilevamento dell’Azoto Totale

Kjeldahl

Si basa su 4 passaggi in base ai quali il campione viene digerito in modo da poter misurare l’azoto che fornisce (sia da fonti proteiche che non proteiche). Per fare ciò, questo azoto viene convertito in ammoniaca, che viene isolata attraverso un processo di distillazione. Successivamente, il contenuto di azoto totale viene determinato indirettamente, attraverso una serie di reazioni chimiche. La sua principale debolezza risiede nella mancanza di differenziazione tra contenuto proteico e non proteico.

Dumas o Metodo di Combustione

La sua base si basa sulla formazione di sostanze gassose a seguito della combustione del campione. Questo produce, tra gli altri, NOx e N2. Dopo aver ridotto gli NOx a N2, viene determinato l’N2 totale. Attualmente sono disponibili analizzatori di azoto che semplificano, abbassano il prezzo e sono più sicuri e veloci delle procedure tradizionali basate sul Kjeldahl. Il problema però è simile a quello del Kjeldahl, non consente la differenziazione tra azoto proteico e non proteico, quindi è suscettibile di adulterazioni.

Fattori di Conversione

Come abbiamo commentato in precedenza, la determinazione dell’azoto presuppone un passaggio precedente per stabilire successivamente il contenuto proteico. Il fattore 6.25 è stato tradizionalmente utilizzato per calcolare la quantità di proteine dai valori di azoto. Si basa sul presupposto che il contenuto di azoto delle proteine sia del 16%. Tuttavia, la realtà è diversa ed è che il contenuto di azoto varia a seconda del tipo di proteina, poiché la composizione degli amminoacidi è diversa.

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Nonostante l’ampiezza di questi fattori, è stato osservato che a seconda dello studio e della metodologia, possono verificarsi forti oscillazioni, anche quando viene analizzato lo stesso tipo di proteina. Un altro limite importante è l’applicazione del fattore 6.25 quando il fattore specifico di una fonte proteica non è noto, in quanto ciò può portare a una stima eccessiva o insufficiente del contenuto proteico.

L’Importanza dell’Aminogramma

In considerazione del fatto che i metodi di analisi dell’azoto totale sono abbastanza sensibili alle manipolazioni, abbiamo bisogno di strategie più precise e che permettano di smascherare possibili frodi.

Cos’è l’aminogramma di una proteina?

L’aminogramma non è altro che la scomposizione e la quantificazione degli amminoacidi che compongono una proteina. La sua determinazione ci consente due tipi di analisi delle proteine:

• Qualitativa: a causa della differenziazione di ciascuno degli amminoacidi.
• Quantitativa: aggiungendo le quantità di ogni amminoacido possiamo ottenere la quantità totale di proteine.

Per poter interpretare rigorosamente l’analisi di un aminogramma, è necessario conoscere preventivamente il profilo amminoacidico della proteina o del campione, in modo da fare un confronto tra il valore ottenuto e il valore che teoricamente dovrebbe registrare.

Come Possiamo Analizzare l’Aminogramma di una Proteina?

Senza dubbio, una delle tecniche più appropriate a questo scopo è l’HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Prima dell’analisi, il campione viene preventivamente trattato, in modo che sia consentita la rilevazione individuale di ciascun amminoacido. Il fondamento della tecnica, a un livello molto elementare, si basa sul fatto che ogni amminoacido ha proprietà differenti a livello fisico-chimico e, variando le condizioni dell’analisi, è consentita la rilevazione sequenziale di questi amminoacidi. Ogni picco corrisponde a un amminoacido e l’area sotto la curva di ciascun picco consente di determinare la concentrazione di quell’amminoacido.

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Test del Biureto

Il test del Biureto è un metodo chimico per il riconoscimento delle proteine. Il campione contenente le proteine viene fatto reagire con il Biureto, un reattivo contenente rame (II) e tartrato di sodio e potassio. Le proteine in ambiente basico e in presenza di ioni $Cu^{2+}$ formano un complesso colorato violetto.

Il test del Biureto è positivo per proteine e polipeptidi, mentre è negativo per dipeptidi ed amminoacidi liberi.

Preparazione del Reattivo di Biureto

1. Si preparano 300 ml di $NaOH$ al 10% m/V.
2. Si pesano separatamente 1,5 g di $CuSO_4$ e 6 g di Sodio e Potassio Tartrato.
3. I due sali vengono disciolti nella soluzione di $NaOH$ al 10% (m/V).
4. Si porta a volume di 1L con acqua.
5. Conservare la soluzione al riparo della luce (contenitore scuro o avvolto in alluminio).

Il reattivo è così preparato in quanto il rame in soluzione, $Cu^{2+}$ in ambiente basico, dovrebbe precipitare come idrossido, $Cu(OH)_2$. La presenza del tartrato mantiene il rame in soluzione attraverso la formazione di un complesso in cui lo ione rameico centrale viene tetracoordinato dagli atomi di ossigeno delle funzioni carbossiliche.

Preparazione del Riferimento Positivo con Albume d'Uovo

1. Rompere l’uovo ed estrarne solo l’albume.
2. Prelevare mediante una siringa circa 1 ml di albume e versarlo in un bicchierino di plastica.
3. Aggiungere 5 ml di acqua all'albume.
4. Versare la soluzione albume-acqua in un provettone (contenitore di vetro).
5. Inserire nella provetta, mediante l’uso di una siringa, 2 ml di reattivo di Biureto.
6. Miscelare energicamente.
7. Osservare la formazione di un cambiamento di colore della soluzione dal blu al viola, dovuta al fatto che il rame viene complessato dai gruppi funzionali della proteina.

La colorazione blu-viola in presenza di proteine è dovuta al fatto che gli ioni rameici del reattivo formano un complesso di coordinazione con gruppi NH (da due a quattro) appartenenti ad altrettanti legami peptidici. Per questo, il saggio sarebbe negativo con amminoacidi liberi e dipeptidi, mentre è positivo per tripeptidi, polipeptidi e molecole proteiche, in cui si ha un sufficiente numero di gruppi $-CONH^-$.

Preparazione del Riferimento Negativo con Acqua Distillata

Il riferimento negativo si può ovviamente considerare quello che si ottiene su acqua distillata, aggiungendovi due ml di reattivo: la colorazione intensa del reattivo mantiene la sua caratteristica tonalità azzurra.

Indagine: Quali Alimenti Contengono Proteine?

L'insegnante propone agli studenti un'attività di indagine basata sulla metodica sperimentale precedentemente messa a punto per testare la presenza o l'assenza di componente proteica in vari tipi di alimenti.

Preparazione dei Campioni (sostanze liquide)

1. Prelevare mediante una siringa circa 1 ml di del campione e versarlo in un bicchierino di plastica.
2. Aggiungere 5 ml di acqua al campione.
3. Versare il campione in un provettone (contenitore di vetro).

Interpretazioni delle Analisi di HSNstore.com

HSNstore.com invia campioni di molti dei suoi prodotti per l’analisi e desidera condividere i risultati con i clienti per mostrare che non esistono imbrogli, poiché la trasparenza è una delle massime priorità. Tali analisi non sono state eseguite da HSN, ma da un laboratorio indipendente, che dispone anche dell’accreditamento dell’Ente Nazionale di Accreditamento.

Accreditamento ENAC

L'ENAC definisce l’accreditamento come “lo strumento istituito a livello internazionale per generare fiducia sulla corretta esecuzione di una tipologia di attività denominate Attività di Valutazione della Conformità e che includono test, calibrazione, ispezione, certificazione o verifica tra gli altri”. Per riassumere, è un modo per garantire che l’ente accreditato rispetti una serie di requisiti, solitamente dettati da normative internazionali come gli standard ISO, UNE o EN.

Esempio di Analisi delle Proteine HSN: 100% Whey Protein Isolate

Vediamo quali informazioni ci forniscono le analisi della pagina HSNstore.com. Per questo useremo l’analisi dell’isolato di proteine del siero di latte come esempio.

Contenuto della Proteina

Prima di tutto, vedremo qual è il contenuto proteico totale secondo le analisi. Troviamo la descrizione o riferimento del prodotto e il relativo lotto. Per quanto riguarda la metodologia utilizzata, possiamo vedere che è stato applicato il metodo Dumas spiegato sopra. Per determinare il contenuto di azoto totale, moltiplicarlo per i fattori 6,25 o 6,38 e ottenere il valore proteico.

Materia Secca

Infine, possiamo vedere il valore proteico nella sostanza secca contrassegnato in rosso dopo aver moltiplicato per 6,38. Come abbiamo visto prima, è il fattore di conversione utilizzato nel caso delle proteine di origine casearia.

Incertezza

Secondo questa analisi, il valore della proteina è 90,22%, anche se dobbiamo tenere presente che questo valore viene raccolto come una media. Pertanto, può variare di una certa percentuale. Questa variazione è nota come incertezza. In questo caso, l’incertezza per questo valore è ± 3.791; Ciò significa che i risultati possono variare tra 86,43% e 94,01%.

Confronto con la Tabella Nutrizionale

Se guardiamo da vicino, questi dati corrispondono perfettamente alla quantità di proteine riportata sulla nostra etichetta: 93 g per ogni 100 g di prodotto, cioè 93%.

Analisi HPLC

Focalizzandosi sull’analisi, la metodologia utilizzata è quella dello standard internazionale ISO 13903: 2005, o che è lo stesso, l’HPLC. Come abbiamo visto, con questa tecnica è facile identificare le frodi. La prima prova Per verificare che il valore proteico fornito sopra sia reale.

Il latte contiene naturalmente una serie di nutrienti chiave, comprese le proteine, che i principali esperti in nutrizione ritengono benefiche per gli esseri umani, indipendentemente dalla loro età. L’azoto proteico derivato dagli amminoacidi rappresenta circa il 95% dell’azoto nel latte. L’azoto non proteico, come l’urea, esiste in quantità minori (circa il 5%). Poiché l’analisi dell’azoto totale Kjeldahl (TKN) non misura direttamente le proteine, il risultato dell’azoto totale viene convertito in percentuale di proteine moltiplicando per un fattore di 6,38.

Nella fase iniziale della digestione, una miscela di solfato di potassio, solfato di rame e acido solforico viene aggiunta in un’ampolla da digestione, contenente un campione di latte pre-pesato e pre-riscaldato (38°±1°C). La soluzione di digestione viene riscaldata e mantenuta a ebollizione per circa 1,5-2 ore. Dopo il raffreddamento, al composto precedentemente digerito viene aggiunta acqua distillata. Successivamente viene trasferito in un’ampolla per la distillazione, dove viene aggiunto idrossido di sodio per neutralizzare la soluzione.

La fase di analisi prevede innanzitutto la titolazione di un campione “bianco” (contenente solo i reagenti senza il campione). Successivamente si esegue la titolazione del distillato contenente il campione. Stavano attualmente misurando l’azoto totale seguendo il metodo ufficiale AOAC 991.20.

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