Le proteine sono molecole dinamiche la cui funzione è strettamente legata alla loro struttura e capacità di cambiare conformazione in risposta a stimoli. Questo articolo esplora la dinamica delle proteine, con un focus particolare sull'allosteria e sulle tecniche proteomiche utilizzate per studiare le proteine.
Allosteria: Il "Secondo Segreto della Vita"
L'allosteria è un fenomeno di fondamentale importanza in biologia che permette la regolazione della funzione e l'adattabilità dinamica di enzimi e proteine. Nonostante la sua scoperta più di un secolo fa, l'allosteria rimane un enigma biofisico, a volte chiamato "il secondo segreto della vita". La difficoltà è principalmente associata alla natura complessa dei meccanismi allosterici che si manifestano come l'alterazione della funzione biologica di una proteina/enzima (cioè il legame di un substrato/ligando al sito attivo) attraverso il legame di un "altro oggetto" (" allos stereos" in greco) ad un sito distante (più di un nanometro) dal sito attivo, il sito effettore.
Pertanto, al centro dell'allosteria, c'è una propagazione di un segnale dal sito effettore al sito attivo attraverso una matrice proteica densa, dove una delle sfide principali è rappresentata dalla delucidazione delle interazioni fisico-chimiche tra i residui di amminoacidi che consentono la comunicazione tra i due siti: le vie allosteriche.
In questo elaborato, viene proposto un approccio multidisciplinare basato sulla combinazione di metodi chimici teorici, che coinvolgono simulazioni di dinamica molecolare dei movimenti delle proteine, analisi (bio)fisiche di sistemi allosterici, inclusi allineamenti di sequenze multiple di sistemi allosterici noti e strumenti matematici basati sulla teoria dei grafi ed apprendimento automatico che può aiutare notevolmente a comprendere la complessità delle interazioni dinamiche coinvolte nei diversi sistemi allosterici. Il progetto mira a sviluppare strumenti veloci e robusti per identificare percorsi allosterici sconosciuti.
Proteomica: Lo Studio su Vasta Scala delle Proteine
La proteomica è lo studio del proteoma, l’insieme delle proteine prodotte o modificate da un organismo o un sistema biologico. Il proteoma è dinamico in quanto le proteine espresse da una cellula possono variare nel tempo. La proteomica viene applicata anche in medicina, per esempio nella ricerca di biomarcatori.
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La proteomica è lo studio su vasta scala delle proteine. Questo tipo di analisi trova applicazione nello studio dei processi biologici in condizioni sia fisiologiche sia patologiche: può infatti fornire informazioni in merito a quali proteine sono espresse in un particolare tessuto o tipo di cellula, alla quantità e alle eventuali variazioni e interazioni.
Poiché le istruzioni per la sintesi delle proteine si trovano nel genoma, e più precisamente nei geni che codificano per proteine, si potrebbe pensare che dalla conoscenza della sequenza di un gene si possano ricavare tutte le informazioni riguardanti la corrispondente proteina codificata. In realtà, i geni specificano solo alcune istruzioni per produrre una proteina, ma non tutte. Inoltre, da un singolo gene può essere prodotto più di un tipo di proteina. Infine, molti geni che codificano per proteine sono espressi e tradotti nelle proteine corrispondenti solo in alcuni tipi di cellule e in particolari momenti della vita di tali cellule.
Per queste ragioni, per conoscere le proteine espresse in una cellula non basta studiare i geni, che è il compito della genomica. Né è sufficiente studiare tutti gli RNA trascritti a partire dai geni, l’oggetto di studio della trascrittomica. Vanno considerati altri meccanismi, che sono in grado di regolare la quantità delle proteine in ciascuna cellula e di modificare la struttura di ciascuna proteina.
Il proteoma, l’insieme cioè delle proteine in una cellula, a differenza del genoma non è quindi costante nel tempo. Per questo, quando si parla di proteoma sarebbe forse più corretto dire che con tale termine si indica l’insieme delle proteine espresse in un particolare organismo o sistema biologico in un dato momento.
Stessi Geni, Diverse Proteine
Il proteoma è quindi un’entità dinamica. Le istruzioni per la costruzione, o meglio la sintesi, delle proteine, sono contenute nel DNA e in particolare nei geni. Gli elementi costitutivi delle proteine sono, a prescindere dalla funzione o dalla forma finale della proteina, gli amminoacidi. Esistono 20 amminoacidi che differiscono tra loro per una specifica porzione nella loro molecola: la cosiddetta catena laterale.
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La sintesi di ogni proteina inizia quando alcune specifiche informazioni presenti in un gene, ossia una precisa sequenza di DNA, sono trascritte in una corrispondente sequenza di RNA messaggero. Quest’ultimo a sua volta viene utilizzato per tradurre il linguaggio dei geni, la sequenza degli acidi nucleici, in una corrispondente catena di amminoacidi. All’interno di ciascuna proteina, gli amminoacidi sono disposti in catene più o meno lunghe e sono legati l’uno all’altro da legami peptidici. Le catene possono quindi “ripiegarsi” su se stesse in particolari forme tridimensionali essenziali alla funzione delle proteine e non specificate dalla sequenza genica.
Una volta formate, le proteine possono inoltre subire ulteriori modificazioni, dette post-traduzionali, che per esempio comportano l’aggiunta di zuccheri o di grassi.
In uno stesso organismo le proteine presenti in ciascun tipo di cellula e tessuto variano molto, anche nel tempo. Possono per esempio variare a seconda dello stadio di sviluppo, delle condizioni interne o degli stimoli che provengono dall’ambiente. Di frequente vengono anche degradate e sostituite. La proteomica studia i diversi aspetti delle proteine, tra cui le possibili interazioni tra le stesse o le loro modifiche.
Tecniche Proteomiche
Esistono molte tecniche per studiare le proteine. Tra quelle più usate in proteomica c’è l’elettroforesi (vedi scheda Tecniche per valutare l’espressione di geni e proteine). In particolare, si può far ricorso all’elettroforesi bidimensionale o 2D PAGE (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis), in cui le proteine contenute nel campione vengono separate su un gel di poliacrillammide in due momenti diversi in base a due loro caratteristiche: il punto isoelettrico e il peso molecolare.
Un’altra tecnica molto usata è la spettrometria di massa, grazie alla quale è possibile identificare e quantificare le proteine in un campione sfruttando il rapporto tra massa e carica.
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I campi di applicazione delle tecniche di proteomica nella ricerca medica sono molteplici.
STAT3: Un Fattore di Trascrizione Intracellulare
STAT3 è un fattore di trascrizione intracellulare mediatore di molteplici processi della proliferazione cellulare, dell'immunità cellulo-mediata, dell'apoptosi e della differenziazione. Viene attivata da JAK per fosforilazione a carico di Tyr705 inducendo la formazione di dimeri. I complessi quindi migrano nel nucleo dove legano specifiche sequenze nei promotori di vari geni target.
In questo studio l'attenzione viene focalizzata su due mutanti di STAT3, causa di due distinte patologie: Y640F e V637M. La prima (Y640F) è una mutazione gain-of-function riscontrata nella leucemia linfocitica granulare a grandi cellule (LGL), una rara sindrome linfoproliferativa cronica.
Sebbene da queste scaturiscano due effetti opposti, le due mutazioni oggetto del lavoro sono strettamente correlate dal punto di vista strutturale. Infatti, i residui Tyr640 e Val637 interagiscono tra di loro, sono entrambi residui superficiali e sono localizzati all'interfaccia di dimerizzazione.
Innovatività della Ricerca su STAT3
La struttura risolta mediante cristallografia ai raggi X dell'omodimero di STAT3 in complesso con un doppio filamento di DNA è stata pubblicata recentemente, a metà del 2019. Nonostante una vasta letteratura sui domini SH2, non ci sono al momento informazioni strutturali o meccanicistiche riguardo al reclutamento e riconoscimento dei substrati fosfatati da parte questi domini.
La comprensione profonda dell'effetto delle mutazioni sulla struttura e la funzione di STAT3 sarebbe pertanto inedita, come sarebbero inediti gli aspetti meccanicistici riguardo al reclutamento dei substrati fosfatati da parte dei domini SH2.
Processi cellulari che coinvolgono le proteine
Trasporto di proteine piccole
Le proteine più piccole non hanno bisogno di trasportatori specifici perché basta il gradiente di concentrazione per farle diffondere o attraverso le membrane ma se parliamo di proteine basta il gradiente per farle diffondere attraverso canali (per esempio alcune proteine possono entrare o uscire dal nucleo senza avere trasportatori specifici).
Esportazione di RNA
L’esportazione di RNA dal nucleo è un processo molto importante perché nel nucleo vengono prodotti tRNA, rRNA e mRNA che poi serviranno nel citosol per produrre le proteine. I tRNA e i rRNA si legano alle esportine e utilizzano il gradiente di ran-GTP per uscire dal nucleo.
In generale questi si legano alle esportine (recettori di esportazione nucleare) nel quale nel nucleo Ran-GTP si lega e promuove il legame esportina-cargo. Questo complesso segue il gradiente di ran-gtp (presente solo nel nucleo e non nel citosol e quindi tende a uscire) e quando esce infatti incontra subito una Ran-Gap che stimola idrolisi di GTP in GDP. Quando si forma Ran-GDP viene rilasciato il carico e poi Ran-GDP seguendo il gradiente ritorna nel nucleo dove c’è ran-GEF che ripristina Ran-GTP che poi agirà di nuovo.
Gli mRNA invece seguono un altro tipo di trasporto mediato da RNA exporter (vengono portati fuori come ribonucleoproteine). Questi sfruttano idrolisi di ATP per essere trasportati. In generale gli RNA exporter sono dei dimeri formati da NXF1(lega RNA, e le sequenze FG) e NXT1 (lega NXF1 e le sequenze FG). Questo dimero (si trova nel nucleo) lega le Fg del poro nucleare e quindi attraversa il poro uscendo da nucleo. Qui interviene un elicasi associata ai filamenti citoplasmatici del poro che rompe il legame tra NXT1 e NXF1 che si disassemblano, rilasciano il cargo e rientrano come monomeri nel nucleo.
Missfolding Proteico
Le proteine vengono prodotte dal ribosoma come lunghe catene polipeptidiche di residui amminoacidici legati con legame peptidico tra di loro. Le proteine per essere funzionanti non devono rimanere in forma distesa ma devono ripiegarsi prima in strutture secondarie e dopo in strutture terziarie e in alcuni casi quaternarie.
Quando una proteina si folda correttamente raggiunge la sua conformazione nativa, che è la struttura con la minore energia libera possibile, la proteina è stabile in questa conformazione e in grado di svolgere le sue funzioni biologiche. Una proteina durante il folding però può andare incontro a ripiegamenti errati che in alcuni casi non sono stabili e vengono corretti, ma in alcuni casi questi folding errati sono stadi di energia libera basi quindi stabili e che sono difficili da correggere. In questo caso la proteina si dice che è missfoldata quindi ripiegata in modo errato.
Quando una proteina è ripiegata in modo errato potrebbe per esempio esporre sulla sua superficie dei residui idrofobici che dovrebbero stare all’interno oppure potrebbe avere una conformazione molto diversa da quella nativa e quindi non essere funzionale. Il caso più dannoso è quando vengono esposti dei residui idrofobici che possono portare ad aggregazione tra più proteine portando a formare degli aggregati di proteine che possono poi risultare citotossici e portare alla morte della cellula.
Quando una proteina è missfoldata intervengono dei sistemi della cellula che possono mandare verso la degradazione questa proteina, uno dei più comuni è quello di degradazione proteasoma dipende. Una proteina può essere riconosciuta da ubiquitine ligasi, essere ubiquitinato ed essere infine degradata. Inoltre il proteasoma 19S quado opera da solo è in grado di riconoscere e degradare in modo molto efficiente le proteine che sono missfoldate. Inoltre alche il proteasoma 20s da solo può degradare le proteine missfoldate in questo caso con un meccanismo ubiquitina indipendente nel quale una proteina con aumentata idrofobicità diventa affine per questo proteasoma e quindi entra e viene degradata.
Autofagia
L’autofagia è un processo messo in atto dalle cellule quando si trovano in condizioni di deprivazione di nutrienti o quando ci sono aggregati proteici da eliminare. Questo processo è molto importante perché permette alla cellula di “mangiare” parti di sé rovinate o non funzionanti bene che possono danneggiarla (aggregati proteici) o componenti cellulari che possano fornire molti nutrienti alla cellula.
Questo consente quindi un riciclaggio delle componenti cellulari danneggiate per formarle nuove e intanto riuscire ad affrontare condizioni in cui mancano amminoacidi nella cellula. La degradazione avviene ad opera dei lisosomi che con le idrolasi acide degradano i componenti che devono essere degradati. Questo è un processo strettamente regolato.
Nell’autofagia si formano specifici comparti cellulari che sequestrano le componenti cellulari che devono essere degradate. Quando viene indotta l0autofagia si formano de novo delle componenti membranose nel citoplasma (fagofori) che si espandono ed diventano poi sferiche e a doppia membrana (autofagosomi). nell’autofagosoma la membrana esterna si fonde con quelle dei lisosomi permettendo la degradazione delle componenti cellulari delimitate dalla membrana interna. Questo processo non è selettivo e media la degradazione di tantissime proteine intracellulari ma anche di organelli (mitofagia). i corpi autofagici sono le componenti cellulari da degradare racchiuse nella membrana interna dell’autofagosoma.
Nell’autofagia abbiamo un sito di assemblaggio del fagoforo (detto PAS). Il fagoforo è una struttura membranosa che inizia a inglobare tutto ciò che deve essere degradato e questo si inizia a formare al PAS e infatti quasi tutte le proteine coinvolte nell’autofagia passano dal pas. Quando il fagoforo si richiude si è formato l’autofagosoma. Le membrane che formano queste strutture derivano dal RE e dal Golgi.
Una delle principali proteine che intervieneregolando l’autofagia è la chinasi TORC1. Questa chinasi è una chinasi che, quando è attiva (in condizioni di abbondanza di nutrinrit9) e inibisce l’autofagia, invece questa è inattiva quando siamo in starvation e in questo caso attiva autofagia. Interviene anche regolando la proliferazione (si quando è attiva no quando è inattivo). Questa serina-treonina chinasi è regolata da EGO 8complesso localizzato a livello del vacuolo e firmanti da 4 proteine Ego1,ego3,gtr1 e Gtr2). Quando questo complesso si trova adavere GTP legata su gtr1 e GDP legata su gtr2 attiva il complesso torc1 invece bellacondizione opposta inattiva torc inducendo autofagia. Questo complesso trovandosi sul vacuolo sente i livelli intracellulari dui leucina e quelli all’interno del vacuolo.
Le proteine che vengono coinvolte nell’autofagia le chiamiamo Atg e sono di vario tipo, alcune sono delle chinasi, altre proteasi altre ubiquitina ligasi. Un esempio è la chinasi Atg1 che forma che forma un complesso con altre Atg(13,17,29,31) e è tutto coinvolto nella formazione dell’autofagosoma. Atg1-Atg13 va a forma un complesso con altre proteine che si attiva in risposta a starvation (atg13, per esempio, si attiva quando torc1 non la inibisce più).
È anche il portante il complesso della fosfatidil-inositolo 3 chinasi che è coinvolto nellanucleazione(processo della mobilitazione delle proteine richieste per l’espansione delfagoforo al pas). Questa chinasi è responsabile della produzione del fosfatidil-inositolo 3 fosfato che è essenziale nella localizzazione di Atg18-Atg2 al PAS. Questipoi sono essenziali per il reclutamento di Atg8,Atg9 e Atg12 al PAS. Atg18 si associa al fosfatidilinositolo 3 fosfato e quindi tutto si associa a Atg2 e questo recluta Atg9 al APS. Atg9 è responsabile del trasporto delle membrane al PAS. esiste anche la proteina Atg8 che può essere coniugata alla fosfatidil etanolammina ( componente importante nelle membrane). Questo viene sintetizzato come precursore con una sequenza che poi viene tagliata da Atg4(proteasi) e poi grazie a Atg7 e Atg3 si forma Atg8 PE che in questa forma si localizza al PAS e nell’autofagosoma dopo Atg4 può anche liverare Atg8 dalle membrane. La fusione tra vacuolo/lisosomi e autofagosoma i complessi Atg8-Pe e Atg12/Atg5-Atg16 si trovano su entrambe le membrane, invece Atg8 pe solo sulla membrana interna quando Atg8-pe deconiuga avviene la fusione.
Nelle cellule di mammiferi mTOR1 viene regolato da fattori di crescita e da insulina, infatti questi attivano il pathway della fosfatidil-inositolo 3 chinasi. Questo pathway va ad attivare la pKB/AKT che a sua volta fosforila la proteina TSC2. Quando TSC2 è fosforilato non è attivo come GAP e RHEB rimane attivo associato a GTP. Se invece TSC2è non fosforilato insieme a TSC1 agisce come GAP e idrolizza GTP su Rhbinattivandola. Rheb se è legata a GTP stimola attività di mTor1 se no la inibisce. Negli eucarioti pluricellulari abbiamo AMPK (proteina sensibili al rapporto intracellulare tra AMP/ATP).
L’inizio dell’autofagia è dettata dal complesso ULK1-FIP200Atg13. Quando AMPK fosforila ULK lo attiva intanto ampk inattiva mtor1) iene attivata autofagia. Se invece è mTor fosforilare Ulk questa fosforilazione blocca autofagia. Quando ulk1 si attiva questo richiama gli Atg all’autofagosoma. Intanto il complesso della chinasi lipidica quando si associa a beclin e altre proteine sintetizza fosfatidilinositolo3fosfato che dirige la migrazione delle proteine a livello del fagoforo. Beclin viene attivato da partedi ULK (fosforilazione=. Inoltre Ampk va anche a fosforilare ATG9 stimolando il reclutamento dove si sta formando autofagosoma . inoltre interviene LC3 che subisce un taglio proteolitico e una coniugazione con etanolammina consentendo associazione con la membrana fagoforo. Dopo di che, quando si sono formati autofagosomi questi si muovono grazie al network di microtubuli e si fondono con i lisosomi.
Saggio per fluorescenza
Il saggio per fluorescenza nell’autofagia è utilizzato per quantificare i processi autofagici e vedere se in una cellula avvenendo autofagia. Uno dei metodi più utilizzati è quello di marcare alcuni marcatori dell’autofagia come LC3 (Atg8) in modo fluorescente e poi osservare al microscopio le cellule e vedere che queste proteine quando vengono lipidate si localizzano a livello di un dot dove vanno a riunirsi anche altre proteine Atg (questo punto è il PAS doge si localizzano le proteine che intervengono nell’autofagia). Infatti gli autofagosomi si localizzano a livello di questo punto dove si collocano le proteine Atg.