Le proteine (dal greco πρώτειος principale, primario) si trovano in tutte le forme note di vita e costituiscono la classe di molecole organiche più abbondanti in tutti gli organismi viventi; si trovano in tutte le cellule e costituiscono il 50% o più del loro peso secco. Sono macromolecole costituite da una o più lunghe catene polipeptidiche (dette anche protidi).
Le proteine sono essenziali per tutti i processi biologici legati alla vita, svolgendo un ruolo fondamentale per la struttura e la funzione cellulare, come nei processi di catalisi enzimatiche, di trasporto e deposito, di supporto meccanico, di protezione immunitaria, di generazione e trasmissione dell’impulso nervoso, di controllo della crescita e della differenziazione. I primi studi fondamentali sulla struttura delle proteine risalgono agli anni 1950.
Struttura delle Proteine
Un discorso sulla struttura delle proteine può essere affrontato ponendo le seguenti domande: quali sono gli amminoacidi costitutivi delle proteine? Qual è la sequenza di questi amminoacidi e quale informazione vi è contenuta?
Le proteine sono costituite da numerose molecole di α-amminoacidi (detti anche residui amminoacidici), legate fra loro mediante legami peptidici tra il gruppo carbossilico di una molecola e il gruppo amminico della successiva, costituendo nel loro insieme una catena polipeptidica. Il peso molecolare delle proteine può variare da circa 5000-10.000 in quelle più piccole (40-80 amminoacidi) sino ad alcuni milioni per quelle più grandi e complesse.
Tra tutti gli amminoacidi presenti in natura solo 20 sono i costituenti fondamentali delle proteine; è importante notare che sono tutti esclusivamente L-isomeri. Ogni proteina è caratterizzata da un punto isoelettrico (pI), cioè da un valore di pH al quale sono uguali il numero delle cariche negative (derivanti dalla dissociazione dei gruppi carbossilici) e il numero di quelle positive (derivanti dalla protonazione dei gruppi amminici) presenti nella molecola proteica; a tale valore di pH, la proteina ha carica netta zero.
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Livelli Strutturali delle Proteine
Le proteine presentano diversi livelli di organizzazione strutturale:
- Struttura primaria: Detta anche struttura covalente, è determinata dalla sequenza dei diversi amminoacidi costituenti la catena polipeptidica, senza alcun riferimento al suo arrangiamento spaziale; questa struttura riguarda l’insieme dei legami covalenti della molecola, sia il legame peptidico che unisce i singoli residui amminoacidici, sia gli eventuali legami disolfuro che possono stabilirsi tra residui di cisteina, anche distanti, all’interno della stessa catena polipeptidica.
- Struttura secondaria: È determinata dalla disposizione strutturale, cioè dalle relazioni steriche, degli amminoacidi che si trovano vicini nella sequenza lineare e permettono alla proteina di ripiegarsi a formare una struttura ripetitiva regolare. Sono state determinate due forme conformazionali più comuni: l’α-elica (elica destrogira) e la struttura β (a foglietto ripiegato).
- Struttura terziaria: Riguarda la disposizione spaziale delle proteine ed è il prodotto dell’interazione tra le catene laterali degli amminoacidi costituenti la proteina che assume, così, una ben definita conformazione tridimensionale. La formazione di queste interazioni dipende esclusivamente dai residui amminoacidici presenti; quindi è la struttura primaria che determina la conformazione tridimensionale della proteina; ovvero, l’informazione necessaria a specificare la complessa struttura spaziale della proteina è contenuta nella sequenza dei suoi amminoacidi. La struttura terziaria definisce l’attività di una proteina; infatti, se una proteina perde la sua conformazione nativa, perde anche la sua attività biologica (denaturazione).
- Struttura quaternaria: Le proteine che sono costituite da più di una catena polipeptidica possiedono un ulteriore livello di organizzazione strutturale, la struttura quaternaria, che si riferisce al modo in cui le catene si associano tramite interazioni non covalenti o legami covalenti trasversali. Ogni catena polipeptidica di queste proteine, dette oligomeriche o polimeriche a seconda del numero complessivo di catene che le compongono, costituisce una subunità.
Classificazione delle Proteine
Le proteine sono classificate tenendo conto fondamentalmente di quattro parametri: la composizione chimica, la forma delle molecole, la solubilità in acqua e la funzione biologica. La composizione chimica permette di distinguerle in proteine semplici e proteine coniugate e la forma delle molecole in proteine globulari e proteine fibrose.
La solubilità in acqua costituisce un criterio che, anche se non del tutto caduto in disuso, è attualmente considerato poco soddisfacente, dato che proteine con struttura e funzioni diverse possono presentare simile solubilità e, al contrario, proteine simili per funzione e struttura presentano solubilità molto diversa.
Infine, la classificazione in base alle funzioni biologiche è quella più utilizzata e anche la più soddisfacente, anche se si deve ricordare che molte proteine possono avere più di una sola funzione. Per es., la proteina contrattile miosina può anche agire come una adenosintrifosfatasi (ATPasi), cioè come un enzima in grado di idrolizzare l’ATP. Nonostante la funzione specifica di molte proteine.
Funzioni Biologiche delle Proteine
Le proteine svolgono una vasta gamma di funzioni biologiche:
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- Enzimi: Gli enzimi rappresentano la classe più grande delle proteine. Alcuni enzimi, detti regolatori, sono in grado, attraverso la modulazione della loro attività catalitica, in risposta a vari tipi di segnali molecolari, di influenzare la velocità di un intero ciclo metabolico.
- Ormoni: Una simile funzione è svolta anche da varie proteine che aiutano a regolare l’attività cellulare fisiologica, come, per es., gli ormoni.
- Materiale di riserva: Un’altra classe di proteine ha la funzione di materiale di riserva, che serve da sostanza nutritiva e da materiale costruttivo per la crescita embrionale; ne sono un esempio l’albumina dell’uovo, la caseina del latte e la ferritina, che è una proteina di deposito del ferro nella milza. Anche nei semi delle piante troviamo proteine di riserva.
- Trasporto: Alcune proteine hanno una funzione di trasporto; infatti esse sono in grado di legare e trasportare nel sangue ioni o molecole più complesse, permettendone il trasferimento da un organo a un altro.
- Strutturali: Un’ulteriore classe di proteine comprende quelle che servono da elementi strutturali, ovvero come filamenti di supporto, cavi o lamine per dare ai sistemi biologici robustezza e protezione.
- Protettive o difensive: Alcune proteine hanno una funzione protettiva o difensiva, come le proteine del sistema di coagulazione del sangue, trombina e fibrinogeno, che impediscono la perdita di sangue in caso di danni al sistema vascolare; la catalasi, la glutationeperossidasi e la superossidodismutasi, che proteggono le cellule dalla tossicità delle specie radicaliche dell’ossigeno. Tra le proteine protettive più importanti bisogna ricordare le immunoglobuline, o anticorpi, prodotte dai linfociti; infatti, esse sono in grado di riconoscere e precipitare, o neutralizzare, batteri, virus, tossine o elementi estranei all’organismo.
Metodi di Studio delle Proteine
I metodi più comunemente utilizzati per l’isolamento, la purificazione e la caratterizzazione delle proteine:
Isolamento
Non esiste una procedura standard per l’isolamento delle proteine da organi e tessuti, anche se la prima tappa del procedimento è di portarle in soluzione, rompendo la struttura del tessuto stesso. Le tecniche utilizzate per questo scopo dipendono dalle caratteristiche meccaniche del tessuto considerato e dalla localizzazione nella cellula della proteina in esame.
Se la proteina si trova libera nel citoplasma, si ricorre alla lisi cellulare, ottenuta con mezzi chimici o meccanici; in alternativa, se la proteina è un componente di una struttura subcellulare, come, per es., membrane e mitocondri, la lisi cellulare deve essere accompagnata da una centrifugazione differenziale, che permette l’isolamento e la purificazione parziale.
Purificazione
La proteina studiata è spesso presente in piccole quantità (〈1%) in una miscela complessa di altre proteine con caratteristiche fisiche simili. Complica il problema il fatto che la purificazione dev'essere effettuata in condizioni blande, poiché valori estremi di temperatura, di pH e composizione del solvente spesso causano l'irreversibile denaturazione della proteina con conseguente perdita dell'attività biologica. Tutte queste difficoltà hanno portato allo sviluppo di tecniche di purificazione molto selettive.
I primi metodi di purificazione si basavano sulla differente solubilità delle proteine in varie soluzioni saline e in tamponi contenenti solventi organici; più recentemente sono stati messi a punto sistemi cromatografici che separano in base a una differenza di carica (scambio ionico), di dimensioni (gelfiltrazione), di specifici legami (cromatografia di affinità); una proteina può essere generalmente purificata usando una combinazione di alcuni di questi metodi.
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Il criterio usuale di purezza, per una proteina, è l'omogeneità, determinata con metodi che separano le proteine in base alla carica (per es. elettroforesi, focalizzazione isoelettrica), alla dimensione (velocità di sedimentazione, elettroforesi su gel in presenza di dodecilsolfato di sodio) e a caratteristiche immunologiche (metodo di O. Vi sono numerosi metodi per la determinazione del peso molecolare delle proteine.
Determinazione della Sequenza degli Amminoacidi
Nel 1955 fu pubblicata la prima sequenza degli amminoacidi di una proteina a molecola relativamente piccola, l'ormone insulina: questo risultato è stato veramente una pietra miliare nello studio della struttura delle proteine, tanto più notevole se si considerano le tecniche relativamente primitive disponibili a quel tempo.
Questo studio non solo ha dimostrato che le proteine hanno struttura chimica definita, ma ha ulteriormente stimolato la ricerca in questo campo: da allora la tecnologia per l'analisi della sequenza degli amminoacidi è stata molto perfezionata e sono state così determinate le sequenze di centinaia di catene polipeptidiche.
La purificazione della proteina comprende la separazione delle diverse subunità, l'apertura dei legami disolfuro e l'alchilazione dei residui di cisteina. Le subunità non identiche, tenute insieme esclusivamente da legami non covalenti (come per esempio nell'emoglobina), possono essere separate per precipitazione frazionata o mediante cromatografia a scambio ionico o gelfiltrazione in solventi che impediscono l'aggregazione.
Queste tecniche possono essere applicate anche nel caso di subunità non identiche unite da ponti disolfuro (come nelle immunoglobuline) previa ossidazione o riduzione e alchilazione dei residui cisteinici: l'apertura dei legami disolfuro tramite ossidazione con acido performico trasforma sia la cistina sia la cisteina in acido cisteico (mentre l'apertura mediante riduzione con 2-mercaptoetanolo trasforma la cistina in cisteina).
Tutte le cisteine inizialmente presenti e quelle prodotte per riduzione della cistina sono poi alchilate per evitare la loro ossidazione spontanea; gli agenti alchilanti più usati sono lo iodoacetato e la etilen-immina, che trasformano la cisteina rispettivamente in S-carbossimetilcisteina e S-amminoetilcisteina.
Nell'ulteriore passaggio la catena polipeptidica viene spezzata in punti specifici, dando luogo a peptidi di cui si determina la sequenza; per spezzare la catena proteica si usano metodi chimici ed enzimatici. Tra gli svariati metodi chimici proposti, uno dei più soddisfacenti è quello che spezza la catena nei punti adiacenti ai residui di metionina per mezzo del bromuro di cianogeno: la reazione procede in modo praticamente quantitativo e poiché in genere vi sono pochi residui di metionina in un polipeptide, con questo metodo si ottiene una miscela di peptidi relativamente semplice.
In teoria, da un polipeptide contenente N residui di metionina si ottengono N+1 peptidi, ciascuno dei quali contiene un residuo di omoserina, eccettuato il frammento carbossi-terminale.
Gli enzimi proteolitici possono essere endopeptidasi (come la tripsina e la chimotripsina), che attaccano la catena polipeptidica all'interno, o esopeptidasi (come la leucinamminopeptidasi e la carbossipeptidasi), che staccano amminoacidi dalle estremità della catena.
Il passaggio successivo comporta la separazione dei peptidi, ottenuti chimicamente o enzimaticamente, mediante l'uso della cromatografia a scambio ionico, della gelfiltrazione o dell'elettroforesi su carta.
Amminoacidi
Dei numerosissimi composti che possono avere questa formula, solo 20 si trovano comunemente nelle proteine; le formule di questi amminoacidi e della prolina, che a rigor di termini è un imminoacido, sono riportate nella tab. I. Nelle proteine sono stati trovati sempre solo amminoacidi della configurazione L, dove L si riferisce alla configurazione assoluta e non all'attività ottica.
Come si vede dalla tab. I, la natura della catena laterale R varia molto nei diversi amminoacidi; questi sono in genere classificati, a seconda della natura della catena laterale, in polari carichi, polari non carichi, e non polari o neutri: i primi hanno nella catena laterale un gruppo ionizzabile e si dividono in basici (lisina, istidina, arginina) e acidi (acido aspartico e acido glutammico); benché il gruppo fenolico della tirosina e il gruppo solfidrilico della cisteina possano ionizzarsi, questi due amminoacidi vengono classificati tra i polari non carichi a causa delle loro caratteristiche complessive.
La presenza di questi gruppi ionizzabili rende le proteine polielettroliti la cui carica varia in funzione del pH: i valori normali di pKa di questi gruppi sono riportati nella tab. La terza categoria, amminoacidi non polari o neutri, comprende glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, metionina e fenilalanina. Quando questi amminoacidi sono sciolti in acqua, le molecole di solvente intorno alle catene laterali tendono a formare strutture ordinate. Le interazioni fra parecchie di tali catene laterali causano una disorganizzazione dell'acqua e, di conseguenza, un favorevole aumento di entropia del sistema; questo tipo di interazione, detta idrofobica, è ritenuto il principale responsabile della formazione e del mantenimento della struttura proteica.
Legame Peptidico
I due principali legami che si riscontrano nelle proteine sono il legame peptidico e il ponte disolfuro. Nel 1902 fu avanzata l'ipotesi che gli amminoacidi fossero uniti con legame peptidico. Quest'ipotesi era basata sulle seguenti osservazioni: 1) benché le proteine come tali contengano pochi gruppi amminici e carbossilici liberi, la loro idrolisi chimica o enzimatica libera quantità eguali di questi gruppi; 2) enzimi capaci di idrolizzare le proteine sono capaci di idrolizzare anche piccoli substrati peptidici sintetici; 3) l'idrolisi parziale delle proteine produce di- e tripeptidi identici a quelli ottenuti per sintesi.
Di particolare interesse è la lunghezza di 1,32 Å del legame C−N; questo valore è intermedio tra quello tipico del legame singolo carbonio-azoto (≈1,49 Å) e quello del doppio legame carbonio-azoto (1,27 Å); ciò indica che il legame peptidico ha notevoli caratteri di doppio legame e che si tratta in realtà di un ibrido di risonanza.
Lo studio dell'idrolisi del composto modello N-benzoil-glicil-tirosinammide indica che l'energia libera di idrolisi del legame peptidico è circa −0,4 kcal/mole; poiché è facile idrolizzare le proteine ad amminoacidi, era prevedibile che questa energia libera fosse negativa. Da questa osservazione si traggono due conseguenze: 1) le proteine sono (relativamente) instabili in condizioni fisiologiche e possono essere degradate in presenza di enzimi idrolitici; da questo punto di vista si comportano come altri polimeri biologici (acidi nucleici, carboidrati), che hanno anch'essi un valore negativo di energia libera di idrolisi; 2) la sintesi delle proteine richiede energia.
Mentre il legame peptidico è il mezzo per unire i vari amminoacidi a formare la catena polipeptidica, il ponte disolfuro tra due semiresidui di cistina serve a stabilizzare la struttura proteica; ciò viene realizzato congiungendo o differenti regioni della stessa catena polipeptidica (legame intracatena) o due differenti catene polipeptidiche (legame intercatene). Per esempio l'insulina. Il legame disolfuro può essere ridotto per trattamento con composti tiolici in eccesso (per es.
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