La macroautofagia, spesso chiamata semplicemente autofagia, è un processo dinamico fondamentale per la sopravvivenza cellulare. Questo meccanismo viene utilizzato per sequestrare e degradare interi organelli o proteine mal ripiegate. Tale processo avviene tramite una struttura vescicolare a doppio strato di membrana, conosciuta con il nome di autofagosoma, che, unendosi con il lisosoma, favorisce la degradazione del substrato.
L'autofagia (dal greco «auto» = sé e «phagein» = mangiare) è il processo mediante il quale componenti citoplasmatici, organelli danneggiati, patogeni intracellulari e aggregati proteici vengono convogliati ai lisosomi per la degradazione.
Si tratta di un meccanismo omeostatico universale in tutte le cellule eucariote, fondamentale per il turnover cellulare. In condizioni fisiologiche o di stress la sua attivazione risulta vantaggiosa, poiché elimina le parti compromesse e fornisce substrati energetici, favorendo la sopravvivenza della cellula.
Autofagia e Neuroprotezione
Negli ultimi anni, è emerso per l’autofagia un ruolo sempre più importante nella neuroprotezione. Infatti, la soppressione dell’autofagia conduce a morte cellulare sia in vivo che in vitro, mentre induttori dell’autofagia rimuovono gli aggregati proteici e riducono la morte cellulare apoptotica.
Recentemente è stato appurato come la PTEN-induced kinase I (PINK1) risulta essere mutata in forme genetiche di malattia di Parkinson. Comunque i meccanismi che collegano PINK1 alla morte di cellule dopaminergiche (DA) rimangono sconosciuti. Isoforme distinte di PINK1 hanno evidenziato essere attive sia all’esterno che all’interno dei mitocondri.
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PINK1 interagisce con la proteina pro-autofagica Beclin1 e con la proteina parkina.
I Meccanismi dell’Autofagia
L’autofagia procede attraverso quattro fasi:
- Induzione
- Formazione dell’autofagosoma
- Fusione con il lisosoma
- Degradazione / riciclo dei componenti idrolizzati
Nei mammiferi operano tre varianti: macroautofagia (la più studiata), microautofagia (invaginazioni della membrana lisosomiale) e autofagia chaperone-mediata - CMA, che riconosce selettivamente proteine contenenti motivi specifici grazie a chaperon citosolici.
Nella macroautofagia porzioni di citosol e organelli interi vengono inglobati dal fagoforo (derivato dal reticolo endoplasmatico) fino a formare l’autofagosoma a doppia membrana. Dopo la fusione con il lisosoma si ottiene l’autolisosoma, nel quale le idrolasi degradano il corpo autofagico; gli amminoacidi liberati ritornano al citosol come substrati energetici o plastici. Dati emergenti indicano che anche microautofagia e CMA concorrono all’omeostasi muscolare.
La regolazione è complessa e ruota intorno alla chinasi mTOR, sensore di nutrienti e inibitore del processo. In carenza di nutrienti mTOR si inattiva, consentendo l’attivazione del complesso VPS34-Beclin 1-VPS15-Ambra1-Atg14, che recluta LC3 sul nascente autofagosoma. La conversione da LC3-I a LC3-II (conjugata alla fosfatidiletanolammina) stabilizza la membrana; per questo LC3-II è il marcatore più affidabile della formazione degli autofagosomi nei mammiferi.
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Il Ruolo di Beclin 1
La regolazione è complessa e ruota intorno alla chinasi mTOR, sensore di nutrienti e inibitore del processo. In carenza di nutrienti mTOR si inattiva, consentendo l’attivazione del complesso VPS34-Beclin 1-VPS15-Ambra1-Atg14, che recluta LC3 sul nascente autofagosoma.
In condizioni basali si assiste nel gruppo PINK1wt all’aumento sia della percentuale di mitocondri positivi alla proteina pro-autofagica Beclin1 che del numero di particelle anti-Beclin1 presenti a livello mitocondriale, al contrario di quanto accade per PINK1W437X e shPINK1 che evidenziano una riduzione.
A seguito della somministrazione di MA viene mantenuto l’andamento riscontrato nelle condizioni basali. L’analisi della percentuale di mitocondri positivi alla parkina e alla co-localizzazione Beclin1-parkina evidenzia nei gruppi PINK1W437X e shPINK1 una diminuzione, sia in condizioni basali che a seguito di somministrazione della MA, mentre nel gruppo PINK1wt si assiste ad un aumento nella percentuale di mitocondri positivi alla co-localizzazione Beclin1/parkina a seguito di somministrazione di MA.
Autofagia Fisiologica
Con un “ruolo di Giano”, l’autofagia sostiene omeostasi, differenziamento, sopravvivenza e, in condizioni estreme, morte cellulare programmata. Durante digiuno, ipossia o assenza di fattori trofici mobilita riserve energetiche garantendo ATP e proteine essenziali; mediante mitofagia e lipofagia controlla la qualità di mitocondri, perossisomi, reticolo e gocce lipidiche, prevenendo l’accumulo di aggregati proteici e contrastando patologie come cancro, malattie neurodegenerative, infezioni.
Inoltre partecipa alla risposta immunitaria eliminando patogeni intracitoplasmatici (xenofagia) e modulando l’infiammazione attraverso il mantenimento della funzione mitocondriale.
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Autofagia e Apoptosi a Confronto
Autofagia ed apoptosi rappresentano processi fisiologici ben distinti all'interno della cellula. L'apoptosi è la forma di morte cellulare programmata (morte cellulare di Tipo I) meglio conosciuta. Essa si verifica attraverso l'attivazione di enzimi catabolici mediante cascate di segnale, che portano alla rapida demolizione delle strutture cellulari e degli organelli.
La macroautofagia prevede che parti del citoplasma e gli organelli citoplasmatici siano sequestrati e indirizzati verso i lisosomi per la degradazione. Entrambi i processi rappresentano due modalità d'eliminazione di cellule e organelli superflui o danneggiati.
L'autofagia rappresenta però anche una risposta d'adattamento delle cellule alla mancanza di nutrienti. La relazione funzionale tra apoptosi ed autofagia è complessa poiché in molte condizioni l'autofagia costituisce un processo di adattamento allo stress che protegge dalla morte cellulare; altre volte, invece, l'autofagia diventa una via alternativa di morte cellulare, detta "morte cellulare di tipo II" o "morte autofagica" (Maiuri et al., 2007).
In alcune circostanze, quindi, apoptosi e autofagia possono esercitare effetti sinergici, mentre in altre situazioni l'autofagia può essere indotta solo quando l'apoptosi è soppressa (Amelio I et al., 2011; Gonzalez-Polo RA et al., 2005). In termini generali, sembra che stimoli simili possano indurre sia l'autofagia che l'apoptosi, quindi è possibile riscontrare un fenotipo misto.
In alcuni setting , infatti, autofagia e apoptosi sembrano essere interconnessi ed è stata ipotizzata l'idea che esistano degli "interruttori molecolari" tra i due processi (Piacentini et al.,2003). Si è supposto che i mitocondri possano avere un ruolo centrale nell'integrazione tra apoptosi e autofagia (Elmore et al., 2001).
L'autofagia è stata anche considerata un meccanismo protettivo contro l'apoptosi. Lemasyers e collaboratori (1998) hanno osservato che, negli epatociti primari, i mitocondri depolarizzati, una caratteristica dell'apoptosi, sono rapidamente eliminati dall'autofagia. L'eliminazione dei mitocondri danneggiati previene il rilascio di sostanze pro-apoptotiche dai mitocontri, prevenendo così l'apoptosi.
Diversi studi sono stati condotti al fine di comprendere più in profondità il delicato equilibrio esistente tra apoptosi ed autofagia ed in grado di garantire la vitalità cellulare in condizioni sperimentali diverse, quali: assenza di nutrienti, inibizione a livello genetico (small interfering RNA contro geni Atg) o farmacologico (3-metiladenina, clorochina, bafilomicina A1).
Da questi studi sono emerse alcune informazioni importanti: l'autofagia, in condizioni di privazione di nutrienti, può conservare l'omeostasi cellulare sopprimendo il processo di morte cellulare attraverso il recupero di metaboliti endogeni e la eliminazione di organelli danneggiati,come i mitocondri, che rilasciano proteine che inducono l'apoptosi (Boya et al., 2005).
Da un punto di vista molecolare, le proteine appartenenti alla famiglia Bcl2 sono coinvolte in entrambi i processi cellulari. In generale, il tipo di stimolo iniziale risulta determinante a stabilire quale processo sarà dominante tra autofagia e apoptosi.
Ad esempio, mentre condizioni di carenza di nutrienti attivano l'autofagia per recuperare ATP, così il danneggiamento del DNA o l'attivazione di recettori di morte (via estrinseca dell'apoptosi) innescano direttamente l'apoptosi precludendo qualsiasi simultanea risposta autofagica.
Recentemente sono stati chiariti, a livello molecolare, alcuni dei meccanismi coinvolti nell'attivazione di questi due processi e si sono evidenziati i segnali che legano apoptosi ed autofagia o che indirizzano la risposta cellulare in una delle due direzioni. Tuttavia si ritiene che le conoscenze attuali sulle intersezioni molecolari tra l'autofagia e l'apoptosi sono ancora largamente frammentarie ed incomplete (Maiuri et al., 2007; Ouyang L. et al., 2012).
Autofagia nel Muscolo
L'esercizio influenza l'omeostasi della cellula muscolare modificando l'ambiente intra- ed extracellulare, compromettendo lo stato energetico e allungando le membrane. Questi fattori di stress conducono ad un rimodellamento del muscolo attraverso eventi di trascrizione e di trasduzione finalizzati a far fronte ad ulteriori modifiche dell'omeostasi cellulare indotte dall'esercizio.
Questi aggiustamenti danno luogo agli effetti benefici dell'esercizio per la salute e migliorano anche le prestazioni sportive. Tuttavia, il rimodellamento implica che la degradazione delle proteine sia, almeno transitoriamente, attivata. Alcuni sistemi enzimatici sono coinvolti nella degradazione delle proteine muscolari.
Accanto al ruolo delle calpaine, caspasi e metallo proteine, l'attivazione del sistema ubiquitin-proteasoma nel muscolo scheletrico durante esercizi di resistenza (endurance exercise) è stato oggetto di particolare attenzione negli ultimi anni (Jamart C, et al., 2012; Kim HJ, et al., 2011). Più recentemente è stato dimostrato che anche l'esercizio di endurance è uno stimolo che induce l'autofagia nei tessuti (Grumati P, et al., 2011; He C, et al. 2012; Jamart C, et al., 2012; Lira VA, et al., 2013).
La macroautofagia -qui chiamata autofagia- è un processo catabolico cellulare che fornisce costituenti cellulari, incapsulati all'interno di vescicole a doppia membrana chiamate autofagosomi (AP), ai lisosomi, i quali provvedono alla loro degradazione. L'autofagia può processare numerosi costituenti cellulari, incluse le proteine solubili, gli aggregati proteici e i mitocondri (Bechet D, et al., 2005; Kirkin V, et al., 2009).
L'identificazione nei mammiferi dei geni dell'autofagia e delle proteine ad essa correlate (Atg) ha permesso di comprendere i meccanismi molecolari responsabili per la formazione dell'autofagosoma (AP) (Klionsky DJ, 2007).
L'autofagia inizialmente era considerata un processo non selettivo di degradazione della massa. Attualmente sono disponibili evidenze che documentano che l'autofagia può avere, come bersaglio aggregati di proteine e organelli, ed è quindi un processo del tutto selettivo.
Per la rimozione selettiva di specifici substrati è noto che sono richieste alcune proteine, incluso il p62/sequestosoma1 (SQSTM1) (Pankiv S, et al., 2007). La Mitofagia si riferisce alla degradazione selettiva dei mitocondri attraverso l'autofagia ed è necessaria per mantenere una sana rete mitocondriale, attraverso l'eliminazione selettiva di mitocondri vecchi e/o danneggiati (Youle RJ and van del Bliek AM, 2007).
Le reti mitocondriali sono dinamiche e sono governate da processi di fusione e di scissione. Questi processi permettono alla cellula di possedere una rete mitocondriale interconnessa e continuamente rinnovata. Sembra inoltre che, un aumento dei processi di scissione mitocondriale, preceda la mitofagia (Youle RJ and van del Bliek AM, 2007).
L'autofagia, nel muscolo scheletrico, è attivata da numerosi stimoli catabolici come la privazione di cibo, la denervazione e la sepsi (Mammucari C et al., 2007; Mofarrahi M, et al.,2012; Zhao J, et al., 2007). Tuttavia, l'evidenza della necessità di un livello basale di autofagia per mantenere l'integrità delle miofibrille è stata contrastata dalla visione di un sistema coinvolto solo nell'atrofia muscolare (Masiero E, et al., 2009).
Molto recentemente è emerso che l'attivazione del sistema autofagia-lisosoma è un processo essenziale per l'adattamento del muscolo scheletrico dopo l'esecuzione di esercizi di endurance (endurance training) (Lira VA, et al., 2013). Pertanto, è sembrato importante studiare le condizioni fisiologiche dell'esercizio durante il quale l'attivazione dell'autofagia è ottimizzata.
Gli autori di questo lavoro preso in considerazione come caso studio (Jamart C et al., Am J Physiol Endocrinol Metab, August 20, 2013 (in press)) hanno ipotizzato che l'autofagia sia attivata in misura maggiore quando l'esercizio di endurance è effettuato in una condizione di digiuno piuttosto che in una condizione di sazietà. A tal proposito, e costituisce l'obiettivo secondario dello studio, gli autori si propongono di spiegare i meccanismi molecolari sottostanti la regolazione dell'autofagia indotta da esercizio nelle sopramenzionate condizioni nutrizionali (digiuno e sazietà).