Prima di affrontare i successivi argomenti è opportuno rivedere la struttura degli acidi nucleici. Il modello a doppia elica del DNA è stato proposto da James D. Watson e Francis H. Crick nel 1953 sulla base delle osservazioni e delle immagini prodotte da Rosalind Franklin (1920 - 1958).
La duplicazione del DNA avviene secondo un modello detto semiconservativo, secondo il quale la molecola si apre come una cerniera e ciascuno dei due filamenti funge da stampo per gli altri due filamenti complementari, perciò ciascuna delle due molecole figlie è costituita da un filamento vecchio e uno nuovo.
La sintesi dei due filamenti complementari avviene contemporaneamente e richiede un gran numero di enzimi (complesso di duplicazione) con un processo assai preciso e accurato.
Entriamo ora nel dettaglio del processo, che si attua in due momenti: inizio e allungamento.
Inizio
In questa prima tappa si ha la despiralizzazione del DNA per la rottura dei legami idrogeno. La duplicazione non parte dall'inizio del cromosoma ma in punti ben definiti, ricchi di A e T - più facili da separare perché tra queste basi ci sono solo due legami idrogeno -, detti punti di origine della duplicazione, e rappresentano segnali di attacco di una proteina iniziatrice, che ha il compito di tendere i due filamenti.
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Di seguito intervengono altre proteine del complesso di duplicazione. La DNA elicasi si lega alla proteina iniziatrice e forza l'apertura della doppia elica, grazie all'energia fornita dall'ATP, rompendo i legami idrogeno tra le basi azotate.
Le proteine SSB stabilizzano i due filamenti impedendo che i filamenti si riassocino. La topoisomerasi (DNA girasi nei Procarioti) impedisce il superavvolgimento del DNA. L'azione combinata di queste proteine consente l'apertura di una bolla di replicazione nei Procarioti - o più bolle contemporaneamente negli Eucarioti - formata da due forcelle di replicazione a forma di Y.
Elementi Indispensabili all'Avvio della Duplicazione del DNA
- DNA elicasi
- DNA topoisomerasi
- Proteine SSB
Allungamento
L'allungamento consiste nell'aggiunta progressiva di nucleotidi trifosfati complementari a quelli presenti nei due filamenti stampo di DNA, secondo le regole di appaiamento. I nucleotidi formano legami fosfodiesterici tra il gruppo ossidrile all'estremità 3' del filamento preesistente e il fosfato del nuovo nucleotide. L'energia è fornita dalla liberazione dei due gruppi fosfato.
La formazione dei nuovi filamenti avviene nelle due direzioni a partire dall'origine della duplicazione. L'appaiamento corretto è reso possibile da una categoria di enzimi chiamate DNA polimerasi, che presentano due restrizioni:
- Non possono far iniziare nuove catene, cioè quelle con una terminazione 5' libera, ma sono in grado aggiungere nucleotidi solo ad altri nucleotidi già correttamente appaiati.
- Possono aggiungere nucleotidi solo all'estremità 3', dove è presente il gruppo -OH. Di conseguenza, l'allungamento del nuovo filamento può avvenire solo in direzione 5' → 3'.
La prima condizione è superata grazie all'enzima primasi, che crea una corta catena di una decina di nucleotidi di RNA funzionanti da innesco, o primer, e consentono alla DNA polimerasi di iniziare l'aggiunta di nucleotidi. Alla fine della duplicazione l'innesco è sostituito da DNA da una DNA polimerasi.
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I due filamenti del DNA sono antiparalleli perciò uno, detto guida (o anticipato, o veloce), si trova nella corretta direzione (5' → 3') e la DNA polimerasi può procedere in modo continuo verso la forcella di replicazione, avendo bisogno di un solo innesco.
Nel filamento 3' → 5' (in ritardo o lento) la sintesi avviene a ritroso in pezzi detti frammenti di Okazaki, ciascuno dei quali richiede un innesco. I frammenti sono poi uniti da una ligasi dopo aver rimosso l'innesco e riempito la parte mancante, purché i monconi siano perfettamente adiacenti.
Schematizziamo le varie tappe di replicazione:
- Una proteina iniziatrice separa i due filamenti della doppia elica e altri enzimi aprono una bolla di replicazione.
- La primasi sintetizza un frammento di RNA che funziona da innesco (primer).
- Una DNA polimerasi allunga la catena (filamento guida) in modo continuo sul filamento stampo 3' e in frammenti di Okazaki nello stampo 5', partendo dalla terminazione 3'-OH dell'RNA.
- La DNA polimerasi nei Procarioti, o DNA polimerasi con altri enzimi ad attività esonucleasica negli Eucarioti, rimuove il primer.
- Una DNA polimerasi riempie il vuoto lasciato dall'RNA.
- La ligasi unisce i frammenti.
Nei cromosomi degli Eucarioti, che sono lineari, la rimozione dell'innesco terminale del filamento lento lascia un vuoto che non può essere sostituito da nuovo DNA in quanto manca un'estremità 3' che la DNA polimerasi possa prolungare, perciò le estremità 5' del filamento stampo non vengono duplicate. Rimane dunque un pezzettino di filamento di DNA singolo che viene tagliato insieme a una piccola porzione di filamento doppio e questo provoca l'accorciamento di circa 50-200 basi del filamento ritardato a ogni duplicazione. Le cellule, dopo 20 - 30 cicli di duplicazione muoiono.
Per evitare questo problema, alcuni cromosomi sono dotati di telomeri alle estremità, sequenze ripetute moltissime volte, che possono essere perdute senza danno. Le cellule del midollo osseo e quelle germinali, invece, sono dotate di telomerasi, un insieme di proteine ed RNA, in grado di aggiungere unità telomeriche.
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Correzione degli Errori
Per quanto accurata sia la duplicazione, si possono presentare errori di appaiamento delle basi oppure modifiche dovute a cause esterne durante la vita cellulare. Le cellule possiedono diverse modalità per rimediare agli errori:
- Correzione di bozze (proofreading): Durante l'allungamento del filamento, la DNA polimerasi fa un controllo immediato della correttezza degli appaiamenti e, in caso di errore, retrocede fino ad incontrare un nucleotide appaiato correttamente, sostituisce subito il nucleotide errato con quello giusto e poi procede con l'aggiunta di nuovi nucleotidi. Questa operazione è possibile in quanto la DNA polimerasi, oltre ad avere la capacità di polimerizzazione, possiede un'attività di esonucleasi in direzione 3' → 5'.
- Riparazione di errato appaiamento: Al termine della duplicazione, se è sfuggito un errore, un'altra DNA polimerasi, insieme a diversi enzimi, rileva errori di appaiamento da anomalie chimiche o strutturali della doppia elica. Un secondo complesso di enzimi con attività di esonucleasi apre una bolla e rimuove il nucleotide errato insieme a quelli adiacenti, dopo aver tagliato il DNA in un solo punto. Una DNA polimerasi riempie gli spazi con i nuovi nucleotidi e, alla fine, la ligasi salda i due monconi.
- Escissione: Un terzo processo di correzione si ha al di fuori della duplicazione, durante tutta la vita della cellula. Alcuni enzimi riconoscono le parti modificate del DNA a causa di agenti fisici, come i raggi UV, o chimici.
Quando e Perché Avviene la Duplicazione del DNA?
Nelle cellule eucariotiche la fase del ciclo cellulare dedicata a questo processo è detta fase S. La replicazione ha luogo durante la fase S del ciclo cellulare e permette di ottenere due molecole di DNA a partire da una sola molecola di DNA. Le molecole di DNA che si ottengono sono costituite da un filamento di origine parentale e da un filamento sintetizzato ex novo.
Il Ruolo degli Enzimi
Alla sintesi del nuovo DNA collaborano diversi enzimi, proteine capaci di accelerare specifici processi biologici. Per convenzione si dice che un filamento va in direzione 5’-3’ (cinque primo-tre primo), mentre l’altro va in direzione 3’-5’ (tre primo-cinque primo). Poiché la DNA polimerasi lavora sempre in direzione 5’-3’, c’è un filamento lungo il quale la sintesi procede velocemente (filamento guida o leading strand), mentre lungo l’altro la sintesi si interrompe a intervalli regolari (filamento in ritardo o lagging strand).
Dato che la sequenza nucleotidica del DNA controlla i processi che avvengono all’interno di ogni cellula e nell’intero organismo, è di fondamentale importanza che quando il DNA si duplica non vengano commessi errori.
La DNA polimerasi possiede la capacità di riconoscere i propri sbagli (ha un’attività di proofreading ossia di “correzione di bozze”). Se due nucleotidi vengono appaiati male, la DNA polimerasi rileva l’anomalia, taglia via il nucleotide scorretto e aggiunge quello giusto.
Telomeri e Telomerasi
Il problema dei telomeri è risolto dall’esistenza di particolari enzimi, detti telomerasi. Normalmente le cellule possiedono un determinato numero di telomerasi e, quando queste non sono più attive, ad ogni replicazione i telomeri si accorciano e la cellula invecchia.
Superavvolgimento del DNA
Durante la replicazione il DNA viene quindi aperto per essere copiato, questo evento causa uno stress alla molecola che per compensare si superavvolge a monte della forca di replicazione in modo da raggiungere una nuova condizione di equilibrio. Questo superavvolgimento compensatorio ovviamente rende difficile l’azione dell’elicasi che si trova bloccata all’interno di un vero e proprio groviglio di DNA.
Nei procarioti la topoisomerasi prende il nome di girasi, e l’enzima taglia un solo filamento di DNA.