La presenza di zuccheri riducenti negli alimenti può essere facilmente dimostrata ricorrendo alla reazione di Fehling. Molti alimenti, di origine sia vegetale che animale, contengono zuccheri riducenti, semplici o complessi. La prova consiste nella ricerca degli zuccheri riducenti negli alimenti tramite una reazione colorimetrica qualitativa basata sulla riduzione dello ione rameico in soluzione.
Principi Fondamentali
I monosaccaridi ed alcuni oligosaccaridi hanno il potere riducente, dovuto alla presenza del gruppo aldeidico libero o emiacetalico. Grazie a questa proprietà il glucosio e gli altri zuccheri riducenti, riscaldati in soluzione alcalina, sono facilmente ossidati con la contemporanea riduzione di un componente del sistema di reazione.
Gli zuccheri semplici (monosaccaridi e disaccaridi) possono essere classificati in due grossi gruppi a seconda che il gruppo carbonilico sia all’estremità della catena dello zucchero (nella sua forma aperta) o in altra posizione: gli aldosi (con il gruppo aldeidico) e i chetosi (con il gruppo chetonico). Il gruppo aldeidico può ancora ossidarsi mentre il gruppo chetonico no, per cui solo gli aldosi possono funzionare da riducenti dando risultato positivo in questa prova (glucosio, lattosio, ecc.). Bisogna tener conto che anche il fruttosio, sebbene contenga un gruppo chetonico non riducente, dà saggio di Fehling positivo grazie alle capacità, tipica degli zuccheri, di spostare il gruppo carbonilico per tautomeria cheto-enolica, facilitato dalle condizioni basiche del saggio.
I polisaccaridi, invece, non danno reazione positiva perché hanno quasi tutti i gruppi aldeidici bloccati, ma possono essere trattati con acido e idrolizzati in modo da liberare i monosaccaridi.
La reazione che avviene in presenza di zuccheri riducenti è un’ossidoriduzione durante la quale il gruppo aldeidico dello zucchero aldoso si ossida a gruppo carbossilico e il rame si riduce formando l’ossido rameoso che è un composto insolubile che precipita conferendo alla sospensione un tipico colore arancione. Tale colorazione, a seconda del campione utilizzato, può variare dall’arancione brillante al rosso scuro al marrone (figura 1).
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La reazione che si verifica è la seguente:$$ R-CHO\ (aq) + CuSO_4\ (aq) \longrightarrow R-COOH\ (aq) + Cu_2O\ (S)$$
E’ una reazione qualitativa perché non ci dice qual è la concentrazione di zucchero nel campione ma solo se è presente oppure no.E’ una reazione colorimetrica cioè una reazione in cui si osserva un cambiamento netto del colore in presenza del composto ricercato; in questo caso si dice che la reazione è positiva (figura 1).
Materiali e Metodi
Fase 1: Preparazione dei Campioni e dei Controlli
Preparare una serie di provette contenenti ciascuna 8 ml di acqua in cui introdurre 0,8 grammi di ogni campione in modo da ottenere soluzioni di glucosio (zucchero riducente) e saccarosio (zucchero non riducente) a concentrazioni note. Per quanto riguarda i campioni di cibo, è sufficiente un pezzo piccolo (8 grammi) che è necessario sminuzzare. Preparare anche una provetta per il controllo negativo contenente solo 8 ml di acqua.
Fase 2: Preparazione del Reattivo di Fehling
Il reattivo di Fehling è una miscela di due soluzioni chiamate Fehling A e Fehling B. Le due soluzioni vanno conservate separatamente, al momento dell'uso si mescolano in parti uguali nella quantità necessaria per l'esperienza. La miscela delle due soluzioni, che ha un colore blu intenso, deve essere utilizzata entro non più di 20-30 minuti dalla preparazione.
- Fehling A: $CuSO_4 \cdot 5H_2O$ (solfato di rame(II) pentaidrato)
- Fehling B: tartrato di sodio e potassio e idrossido di sodio
Lo ione rameico non è normalmente stabile in ambiente basico poiché tende a precipitare come idrossido rameico. E qui sta la grande capacità di von Fehling che riuscì a pensare al tartrato di Sodio e Potassio quale agente complessante degli ioni $Cu^{++}$ , che impedisce loro di reagire con gli ioni OH in soluzione, Ovviamente la stabilità di tale complesso è limitata e nel tempo gli ioni $Cu^{++}$ tenderebbero comunque a precipitare come idrossido rameico; perciò è importante tenere i due reattivi separati fino al momento dell'uso
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Fase 3: Allestimento della Reazione di Fehling
Dopo aver preparato i singoli campioni si aggiungono a ciascuna provetta 2-3 ml di reattivo di Fehling. Tale operazione va effettuata su tutte le soluzioni preparate compreso il controllo negativo (acqua) ed il controllo positivo (acqua + glucosio) che costituiranno i colori di riferimento per la successiva lettura dei risultati.
La reazione di Fehling avviene a caldo, quindi, dopo aver aggiunto al campione da testare il reattivo di Fehling, si scaldano le provette a bagnomaria. A tale scopo occorre allestire il sistema per il riscaldamento e introdurre le provette un po' alla volta partendo da controlli (negativo e positivo). Il tempo necessario è di circa 3-5 minuti. Se il campione non si solubilizza si consiglia di mescolare, con una bacchetta di vetro, durante il riscaldamento.
In presenza di zuccheri riducenti il liquido acquisterà una colorazione variabile tra il giallo-uovo, l'arancio ed il rosso mattone. Lasciando a riposo la provetta per un po' di tempo il colore si depositerà sul fondo sotto forma di un precipitato insolubile di composti di rame.
Fase 4: Valutazione dei Risultati
Osservare il colore assunto dai diversi campioni utilizzati e compilare la scheda di lavoro allegata, annotando anche eventuali osservazioni. La comparsa di una colorazione arancione-rosso mattone indica che si è verificata la reazione attesa e quindi il campione contiene zuccheri riducenti, viceversa un risultato negativo (nessun viraggio di colore) indica che non si è svolta la reazione e nel campione non sono presenti zuccheri riducenti.
Le soluzioni contenenti zuccheri riducenti quali fruttosio, glucosio o lattosio dovrebbero diventare rosse e formare un precipitato rosso (gli ioni rameici disciolti vengono ridotti a ossido rameoso insolubile), mentre non dovrebbe esserci variazione di colore con il saccarosio.
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La comparsa di altre colorazioni deve essere commentata anche tenendo conto del colore iniziale del campione che potrebbe interferire nella lettura del risultato. Ad esempio la ricerca in un campione di succo di frutta alla pesca o arancia non può dare risultati leggibili con questo metodo per via del colore iniziale, oppure in un cioccolatino perché colora di marrone la soluzione e l'arancione non è quindi visibile. Se si vuole analizzare gli zuccheri nel latte conviene prima far precipitare le proteine con acido acetico.
Usando la cipolla rossa di Tropea compare una colorazione verde dovuta probabilmente a coloranti dell'epidermide che si solubilizzano e danno interferenza; senza buccia compare un colore verde-giallo ma, lasciando a riposo una mezz'oretta, vira verso l'arancione dimostrando la presenza di zuccheri riducenti.
E' comunque importante discutere anche dei casi dubbi in modo da stimolare l'analisi critica da parte dei ragazzi.
Considerazioni aggiuntive
L'esperienza viene svolta con interesse dagli allievi proprio perché, dopo aver acquisito il metodo, si lavora sugli alimenti e si ragiona sul loro contenuto in zuccheri semplici, partendo anche dall'analisi delle etichette nutrizionali. E' una prova che permette anche di discutere sulla leggibilità dei risultati e sulla necessità di scegliere in modo opportuno i test di analisi, visto che in alcuni casi gli studenti non sono in grado di distinguere il colore finale da quello iniziale del campione oppure ottengono cambiamenti di colore ma un po' diversi da quelli attesi.
Il reattivo di Fehling è un reagente specifico per il carattere riducente di taluni glucidi, sviluppato dal chimico tedesco Hermann von Fehling nel 1848
Hermann von Fehling
Hermann von Fehling (Lubecca, 9 giugno 1812 - Stoccarda, 1 luglio 1885 ). Si iscrisse in Chimica all'Università di Heidelberg verso il 1835 con l'intenzione di diventare farmacista. Dopo essersi laureato si recò a Gießen come tecnico nel laboratorio di Justus Liebig, e qui chiarì la composizione della paraldeide e della metaldeide. Nel 1839, su raccomandazione di Liebig ottenne la cattedra di chimica al politecnico di Stoccarda, incarico che mantenne per più di 45 anni. Si occupò di vari argomenti di chimica analitica (introdusse, come detto, il reattivo che prende il suo nome) e di chimica organica (acidi grassi, resine, ammidi, ecc.). Fra i suoi primi lavori, ricerche sull'acido succinico e sull'acido disuccinico, e mise a punto la preparazione del cianuro di fenile (meglio noto come benzonitrile) per disidratazione del benzoato di ammonio; introdusse per l'occasione la denominazione di «nitrili» per gli analoghi composti organici. Più tardi si dedicò principalmente alla tecnologia e alla sanità pubblica, piuttosto che alla chimica pura. Fra i metodi analitici ai quali ha lavorato il più conosciuto è quello per la determinazione quantitativa degli zuccheri per mezzo del reattivo Fehling, composto di due liquidi, uno preparato a partire da solfato di rame cristallizzato e l'altro da tartrato sodico di potassio. Le due soluzioni vanno conservate separatamente e si mescolano in parti uguali a l momento dell'uso.
Misurando la quantità di agente ossidante che viene ridotta da una soluzione di zucchero, diventa possibile determinare anche la concentrazione dello zucchero. Per molti anni la concentrazione di glucosio nel sangue o nelle urine è stata valutata con questo metodo per diagnosticare il diabete mellito. Ora disponiamo di metodi più sensibili per misurare la concentrazione di glucosio nel sangue usando un enzima, la glucosio ossidasi
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