In biochimica e biologia molecolare, la sequenza di una proteina rappresenta la successione ordinata degli amminoacidi che la compongono, ovvero la sua struttura primaria. Allo stesso modo, la sequenza nucleotidica del DNA è la successione ordinata di nucleotidi che costituiscono il DNA stesso. Esiste anche la sequenza di nucleotidi che si trova in forma identica ma invertita.
Meccanismo del Segnale e Inserimento delle Proteine nelle Membrane
Il reticolo endoplasmatico (RE) è coinvolto non solo nella sintesi dei lipidi di membrana, ma anche nella sintesi delle proteine integrali di membrana. Come per i lipidi, le proteine vengono caricate inizialmente nelle membrane del RE e successivamente fluiscono lungo il complesso di Golgi verso la membrana plasmatica. Esiste anche un flusso di proteine dalle membrane del RE ruvido verso la membrana nucleare.
Le proteine vengono inserite nelle membrane del RE attraverso un processo noto come meccanismo del segnale. Gli RNA messaggeri (mRNA) di queste proteine contengono una sequenza che, tradotta in catena polipeptidica, costituisce un segnale all’inizio della proteina (peptide-segnale). Questo segnale fa sì che la catena polipeptidica e i ribosomi che la assemblano aderiscano al RE.
Dopo l’adesione, il peptide-segnale, che contiene un segmento idrofobico in grado di attraversare la membrana, promuove l’entrata del polipeptide nella membrana stessa. Successivamente, il peptide-segnale viene enzimaticamente rimosso dopo aver svolto la sua funzione.
L’aggiunta di eventuali gruppi glucidici avviene nel reticolo endoplasmatico e si completa nel complesso di Golgi. I primi gruppi glucidici vengono aggiunti alle proteine di nuova sintesi che sono rivolte verso l’interno delle cisterne del RE. Questi gruppi glucidici vengono allungati man mano che le proteine si spostano attraverso il complesso di Golgi. Le unità glucidiche complete, qui come nel RE, sono rivolte verso l’interno delle vescicole che si staccano dal Golgi. La fusione delle vescicole con la membrana plasmatica dispone i carboidrati sulla superficie esterna della cellula.
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Proteine di Membrana degli Organelli
Le proteine di membrana di mitocondri e altri organelli cellulari derivano da ribosomi che non sono associati a membrane ma sono liberi nel citoplasma. Dopo essere state sintetizzate, queste proteine penetrano negli organuli mediante un processo analogo a quello del meccanismo del segnale. Molte di queste proteine si trovano inizialmente in una conformazione che espone i gruppi aminoacidici polari sulla superficie, rendendole solubili nel citoplasma.
Dopo aver raggiunto la membrana dell’organulo bersaglio, esse vanno incontro ad un cambiamento conformazionale che promuove la loro inserzione nella membrana, con le regioni apolari localizzate all’interno e quelle polari esposte sulla superficie della membrana. Un gruppo di proteine dette chaperonine mantiene le proteine di membrana degli organelli nella conformazione che facilita il loro trasferimento attraverso il citoplasma e l’inserzione nelle membrane bersaglio.
Sequenziamento delle Proteine e del DNA
La determinazione della sequenza di nucleotidi caratteristica di una molecola di acido nucleico, o anche della sequenza degli amminoacidi di una proteina si esegue attraverso il sequenziatore: il peptide da sequenziare contenente n amminoacidi è immobilizzato, per reazione della sua estremità N-terminale, a un supporto solido, mentre l’amminoacido C-terminale viene staccato selettivamente.
La prima proteina sequenziata è stata l’insulina. La pubblicazione (F. Sanger, 1953) di tale sequenza è storicamente importante, perché ha fatto intuire l’esistenza di un meccanismo di sintesi proteica così preciso da assicurare una corrispondenza univoca fra sequenza amminoacidica delle proteine e sequenza nucleotidica del DNA.
Tutti i metodi utilizzati per la determinazione delle sequenze nucleotidiche del DNA impiegano enzimi di restrizione (➔ enzima), i quali procurano specifici punti di riferimento per la determinazione della sequenza in quanto riconoscono e tagliano il DNA in corrispondenza di corti oligonucleotidi specifici. Si originano in tal modo una serie di frammenti di restrizione, lunghi 100-200 nucleotidi, costituiti da DNA a singolo filamento, dei quali è possibile successivamente determinare la sequenza.
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Tutte le tecniche comunemente usate si basano sulla produzione di gruppi di frammenti a filamento singolo di dimensioni crescenti. I due principali metodi adottati per sequenziare il DNA variano soprattutto per quanto riguarda il modo con cui il DNA viene marcato e il modo con cui sono prodotti frammenti di dimensioni crescenti.
Tecniche di Sequenziamento del DNA
La prima tecnica, sviluppata da A. Maxam e W. Gilbert, utilizza specifiche reazioni chimiche per creare gruppi di frammenti di dimensioni crescenti, che terminano con uno specifico nucleotide all’estremità 3′: adenina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) e sono tutti marcati all’estremità 5′. La posizione di ciascun frammento dei 4 gruppi si può individuare mettendo a contatto il gel radioattivo con una pellicola per raggi X ed esponendola opportunamente. Sviluppata la pellicola si osservano una serie di bande, ciascuna delle quali rappresenta un particolare frammento di una certa dimensione; la sequenza del frammento può essere letta direttamente dalla pellicola partendo dall’estremità 5′.
La seconda tecnica, sviluppata da F. Sanger, prevede l’uso di un processo di sintesi enzimatica di una nuova catena di DNA, utilizzando un’elica di DNA come stampo. I frammenti di diversa lunghezza si formano in quanto vengono aggiunti didesossiribonucleotidi alla miscela di reazione; questi nucleotidi sono analoghi ai 4 corrispondenti desossiribonucleotidi ma, a causa della loro composizione chimica, bloccano la sintesi dei nuovi filamenti di DNA.
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