Le informazioni contenute nel DNA vengono utilizzate dalla cellula per sopravvivere ed esercitare le proprie funzioni attraverso la sintesi delle proteine, macromolecole che svolgono molti ruoli biologici (strutturale, catalitico, regolatorio…). Il passaggio dal gene, l’unità funzionale del DNA, alla proteina avviene in due fasi: la trascrizione del DNA genera l’RNA, la traduzione dell’RNA porta alla sintesi della proteina.
Possiamo immaginare il DNA come il manuale di istruzioni della cellula. Questo manuale è diviso in capitoli, i geni. È stato stimato che il genoma umano (l’insieme dei geni presenti nel DNA delle cellule umane) contenga circa 20.000 sequenze che forniscono alla cellula le istruzioni per sintetizzare proteine (in gergo si dice che “codificano una proteina”). La porzione di DNA non codificante è enorme e il suo ruolo non è ancora ben compreso. Si ipotizza che buona parte di questo abbia funzioni regolatorie ed è noto che i telomeri, porzioni di DNA non codificante poste alla fine dei cromosomi, servono a proteggere il DNA.
Il Processo di Sintesi Proteica
Non tutte le proteine vengono sintetizzate in ogni cellula e/o in ogni momento. Il primo passaggio nella sintesi di una proteina consiste nella trascrizione del DNA, che possiamo considerare come un “ordine di produzione”. In questo processo, la sequenza del gene viene copiata mediante la sintesi di una molecola di acido ribonucleico (RNA). Come il DNA, l’RNA è costituito da nucleoidi contenenti un gruppo fosfato, uno zucchero (il ribosio) e una base azotata (adenina, citosina, guanina e uracile [U], questo ultimo in sostituzione della timina presente nel DNA).
Similmente a quanto avviene nella duplicazione, un filamento di DNA funge da stampo per la sintesi del nuovo acido nucleico: il filamento di RNA è quindi complementare al filamento di DNA. L’enzima chiave della trascrizione è l’RNA polimerasi. Questo enzima, assieme a proteine accessorie, si lega al DNA in corrispondenza di una zona a monte del gene che deve essere trascritto, chiamata promotore. Sequenze chiamate enhancer controllano l’attivazione della trascrizione. Man mano che la doppia elica di DNA si svolge, l’RNA polimerasi aggiunge nucleotidi al filamento di RNA; la sintesi avviene in direzione 5’-3’.
- L’RNA polimerasi II sintetizza l’RNA messaggero (mRNA) che codifica la sequenza della proteina.
- L’RNA polimerasi I e III sintetizzano l’RNA ribosomiale (rRNA) e l’RNA transfer (tRNA) coinvolti nel processo di traduzione.
Una sequenza di stop segnala alla polimerasi quando interrompere la sintesi dell’RNA. L’RNA messaggero subisce poi un processo di maturazione, in cui vengono eliminate alcune sequenze intercalanti (introni) e mantenute solo le sequenze codificanti (esoni); l’RNA maturo è perciò più corto di quello appena sintetizzato (pre-mRNA). Grazie al processo di splicing, da un singolo trascritto possono essere generati più mRNA maturi che codificano forme alternative di una stessa proteina.
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Quando la cellula è in possesso dell’ordine di produzione (mRNA), può inviarlo alle fabbriche delle proteine, i ribosomi. È in questi organelli, costituiti da proteine e rRNA e localizzati nel citoplasma, che avviene l’assemblaggio della proteina. Il processo di traduzione dell’RNA si basa sull’esistenza di un codice genetico che mette in relazione la sequenza del DNA con la sequenza degli amminoacidi, le unità base delle proteine.
Esistono 20 tipi di amminoacidi (leucina, glicina, metionina…). Una sequenza di tre nucleotidi è detta codone e codifica l’informazione per un singolo amminoacido. Il codice è ridondante: più codoni possono codificare per lo stesso amminoacido. Un esempio per chiarire: sia il codone AAA che il codone AAG codificano per la lisina, ma sia il codone AAA sia il codone AAG codificano solo per la lisina. Esistono 3 codoni di stop, che segnalano la fine della sequenza codificante. Gli amminoacidi arrivano nel ribosoma trasportati dai tRNA. Una porzione del tRNA (anticodone) si appaia al codone corrispondente e permette che sia il corretto amminoacido a legarsi alla catena di amminoacidi nascente. Mutazioni nella sequenza nucleotidica portano a mutazioni nella sequenza amminoacidica della proteina.
Espressione Genica e Proteica
Tutte le cellule di un organismo hanno lo stesso DNA, ma ciascuna cellula utilizza solo una parte di questo grande insieme di istruzioni genetiche. A seconda del tipo cellulare, del momento dello sviluppo e degli stimoli ambientali, una cellula usa infatti solo i geni che contengono le istruzioni necessarie a svolgere precise funzioni. Per indicare questo utilizzo selettivo, si dice che la cellula esprime determinati geni e non altri.
- Un gene che contiene le istruzioni per produrre una proteina viene espresso quando viene trascritto, ossia quando viene generata una molecola di RNA messaggero (mRNA) con la stessa sequenza del gene.
- Una proteina invece è considerata espressa quando l’mRNA che contiene le istruzioni per produrla viene effettivamente utilizzato per tradurre il linguaggio della genetica in quello delle proteine. In pratica, ciascun mRNA è usato come guida per creare una catena di amminoacidi con una precisa sequenza corrispondente.
Tuttavia, una cellula che esprime l’mRNA corrispondente a una proteina non necessariamente la produce. Sapere quali geni e quali proteine sono effettivamente espressi fornisce informazioni sui processi biologici che stanno avvenendo nelle cellule. Da queste informazioni si può per esempio capire quali molecole sono implicate in quali malattie e identificare possibili bersagli per i farmaci. Di seguito sono descritte alcune tecniche con cui si può analizzare l’espressione di uno o pochi geni e di una o poche proteine.
Analisi dell’Espressione Genica
Una delle prime tecniche messe a punto per l’analisi dell’espressione genica in una cellula è il Northern blot. Utilizzando particolari reagenti, si lisano (ossia si distruggono) le membrane delle cellule e si estrae l’RNA (l’insieme degli mRNA e di altri tipi di RNA). L’RNA purificato viene poi separato nelle molecole di diverse dimensioni mediante elettroforesi su gel di agarosio. In breve, il campione contenente tutti gli RNA viene depositato in un pozzetto ricavato in una mattonella di gel di agarosio. Il gel viene quindi messo in un apparato che crea un campo elettrico che lo attraversa da parte a parte. Poiché gli acidi nucleici come l’RNA sono carichi negativamente, le molecole entrano nel gel e si muovono dal polo negativo verso il polo positivo. Siccome le molecole più piccole si muovono più velocemente, le molecole di RNA si separano lungo la dimensione verticale del gel in base alle dimensioni. Una volta bloccata la migrazione, il gel viene posto a contatto con una speciale membrana: grazie al fenomeno fisico della capillarità, l’RNA passa dal gel alla membrana. La membrana viene quindi messa in incubazione con una sonda radioattiva o luminescente (un frammento di DNA con la sequenza dell’mRNA che si vuole cercare, contenente fosforo radioattivo). La sonda si lega alla membrana in corrispondenza delle molecole di mRNA di interesse. Infine, la membrana viene messa a contatto con una lastra radiografica e la radioattività della sonda impressiona la lastra creando delle macchie nere. Dalle macchie è possibile stabilire se un campione contiene l’mRNA per un determinato gene e se un campione ne contiene più o meno di un altro. Il Northern blot è una tecnica oggi abbastanza desueta, perché richiede tempi lunghi e l’utilizzo di materiale radioattivo.
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Al momento, invece, la tecnica più utilizzata per valutare l’espressione genica è la real-time PCR (RT-PCR). Si parte sempre con l’estrazione e la purificazione dell’RNA. Il campione di RNA viene poi usato come stampo per sintetizzare in provetta il suo DNA complementare (cDNA): utilizzando i mattoncini di cui sono fatti gli acidi nucleici (i nucleotidi) e uno specifico enzima (trascrittasi inversa), vengono create delle copie fatte di DNA degli mRNA presenti nel campione. Il cDNA così ottenuto viene poi utilizzato in una reazione di PCR (polymerase chain reaction). Si mescolano il cDNA, piccoli frammenti di DNA con sequenze specifiche del gene di interesse (primer) e un enzima che sintetizza il DNA (DNA polimerasi). Uno speciale strumento (termociclatore) porta il campione alle temperature idonee perché i filamenti di DNA si separino e possano avvenire le reazioni biochimiche che permettono la sintesi di nuovi frammenti di DNA. Ogni ciclo di PCR genera 2 molecole di DNA per ogni molecola che fa da stampo. Il processo è esponenziale: se all’inizio c’erano 2 molecole di cDNA (e quindi, originariamente, di mRNA) per il gene di interesse, dopo un ciclo se ne ottengono 4, dopo due cicli 8 e così via. Nella real-time PCR, la miscela di reazione contiene una molecola fluorescente che si inserisce nel DNA di nuova sintesi. Lo strumento misura la fluorescenza del campione, proporzionale alla quantità di DNA sintetizzato, man mano che si susseguono i cicli di reazione (real time significa in tempo reale). Quantificando il segnale fluorescente si può stabilire se un campione conteneva l’mRNA di interesse e confrontare l’espressione del gene in campioni diversi. Le macchine per la real-time PCR possono analizzare molti campioni alla volta, anche alcune centinaia se il processo è automatizzato. Utilizzando primer diversi si possono studiare più geni contemporaneamente in tempi ridotti.
Se si vogliono valutare con un singolo esperimento tutti gli mRNA espressi dalle cellule, ossia il loro trascrittoma, si utilizzano tecniche come i microarray e l’RNA-seq (vedi scheda sulla trascrittomica).
Analisi dell’Espressione delle Proteine
Per quanto riguarda l’analisi dell’espressione delle proteine delle cellule di interesse, la tecnica di laboratorio maggiormente usata è il Western blot. Per prima cosa si lisano le membrane delle cellule con una soluzione che contiene sodio dodecilsolfato (SDS), una molecola organica che si lega alle proteine linearizzandole, cioè distruggendone la fisiologica struttura tridimensionale data dalla sequenza degli amminoacidi. Le proteine vengono poi separate mediante elettroforesi su gel di acrilammide: si produce un gel di acrilammide dello spessore di pochi millimetri facendolo solidificare tra due lastre di vetro e a un’estremità si formano dei pozzetti in cui si depositano i campioni. Il gel è quindi messo in un apposito apparato che crea un campo elettrico in grado di attraversare il gel per il lungo, da parte a parte. Poiché l’SDS dà alle proteine una carica negativa, esse si muovono nel gel verso il polo positivo. La distanza percorsa nel gel dipende dalla lunghezza di ciascuna proteina e proteine più piccole si muovono più velocemente. Le proteine si separano quindi in base alle dimensioni. Il gel viene poi posto a contatto con una speciale membrana. Sfruttando un campo elettrico generato da un altro apparato, le proteine vengono così trasferite dal gel alla membrana. La membrana viene quindi messa in incubazione con un anticorpo (anticorpo primario) che riconosce soltanto la proteina di interesse. A questa segue una seconda incubazione con un altro anticorpo (anticorpo secondario) che riconosce gli anticorpi primari immobilizzati sulla membrana. L’anticorpo secondario è coniugato a un enzima capace di catalizzare una reazione chimica che emette luce (chemiluminescenza) quando viene fornita l’apposita molecola reattiva (substrato). Dopo avere attivato la chemiluminescenza, la membrana viene messa a contatto con una lastra fotografica e la luce emessa impressiona la lastra creando delle macchie nere in corrispondenza della proteina di interesse. Oggi in genere al posto delle lastre fotografiche si utilizzano dei sistemi di imaging in grado di convertire il segnale luminoso in un segnale digitale, che può essere registrato e analizzato da un computer.
È possibile valutare se le cellule esprimono una proteina solubile (ossia che viene rilasciata all’esterno della cellula) raccogliendo un campione del liquido in cui sono state fatte crescere le cellule e analizzandolo con il test ELISA (ELISA sta per “enzyme-linked immunosorbent assay”). Come il Western blot, anche questo test immunoenzimatico si basa sul riconoscimento di una proteina di interesse da parte di un anticorpo specifico. In breve, l’anticorpo primario è immobilizzato sul fondo di una piastra multipozzetto. Si deposita il campione in un pozzetto così che la proteina si leghi al suo anticorpo corrispondente. Ogni piastra può contenere fino a un centinaio di campioni. Si lava via ciò che non si è legato e si riempiono i pozzetti con una soluzione contenente un anticorpo secondario coniugato a un particolare enzima. Dopo ulteriori lavaggi, si riempiono i pozzetti con una soluzione di un substrato che quando viene modificato chimicamente dall’enzima cambia colore. Quindi, con uno strumento chiamato spettrofotometro si misura l’intensità del colore e, confrontandola con quella del colore sviluppato nei pozzetti dove sono state messe quantità note della proteina di interesse, non solo è possibile dire se la proteina è espressa, ma anche quanta ne viene prodotta.
Per valutare l’espressione di proteine presenti sulla membrana esterna delle cellule o di proteine solubili è anche possibile usare la citometria a flusso.
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Biologia Molecolare in Oncoematologia
La biologia molecolare è una branca recente della biologia che studia la struttura e le funzioni del DNA (acido desossiribonucleico), la sua trascrizione in RNA (acido ribonucleico) e la successiva formazione di proteine. Alla base vi sono le proprietà della doppia elica del DNA, che è formato da unità ripetitive e complementari, composte da solo 4 basi azotate diverse (adenina, guanina, timina e citosina).
La progressiva evoluzione biotecnologica ha consentito di sequenziare il DNA, conoscendone così la normale composizione e facilitando l’individuazione di mutazioni associate a numerosissime patologie. Le metodiche più utilizzate in biologia molecolare sono quelle della PCR (polymerase chain reaction), che permettono di amplificare piccoli tratti di DNA ed individuare alterazioni geniche anche con la presenza di poche cellule.
Le indicazioni della biologia molecolare in oncoematologia sono molteplici. Dal punto di vista diagnostico le tecniche di biologia molecolare sono divenute di complemento alle tecniche di morfologia, immunologia e citogenetica. Le malattie nelle quali si applica di routine sono le leucemie acute, la leucemia mieloide cronica e le malattie linfoproliferative croniche, anche se metodiche di biologica molecolare si stanno espandendo ormai in tutte le patologie oncoematologiche.
La biologia molecolare in ematologia ha numerosissime implicazioni cliniche:
- Permette di confermare la diagnosi di patologie specifiche. Ad esempio, il riscontro di mutazione di JAK2 nella policitemia vera, di JAK2, CALR o MPL nella trombocitemia essenziale, di BCR-ABL1 nella leucemia mieloide cronica o di PLM-RARα nella leucemia acuta promielocitica.
- Consente di definire differenti sottotipi di leucemia acuta, con caratteristiche cliniche specifiche, prognosi e risposta alle terapie distinte. Ad esempio, è essenziale la ricerca della mutazione di NPM1 nella leucemia acuta mieloide, in quanto caratterizza un'entità con prognosi piuttosto favorevole e sensibilità maggiore a certi farmaci.
- Permette di riconoscere lesioni molecolari che possono essere il target (bersaglio) per indirizzare terapie mirate. Un esempio è la mutazione di FLT3 nella leucemia acuta mieloide, che può essere colpita da terapie a bersaglio molecolare (inibitori di FLT3), o di BCR-ABL nella leucemia acuta linfoide Philadelphia - pos.
- È utile nella valutazione della risposta alla terapia, con tecniche diverse a seconda delle patologie. Attraverso il monitoraggio della malattia minima residua consente infatti di valutare precisamente la sensibilità al trattamento e di individuare precocemente possibili recidive. Ciò è particolarmente rilevante nelle leucemie acute e nella leucemia mieloide cronica, ove è consolidata nella pratica clinica, ma è oggi sempre più utilizzata anche in patologie come mieloma e linfomi.
L’avvento di moderne tecniche di sequenziamento, veloci e relativamente poco costose, ma che consentono di valutare le mutazioni in moltissimi geni contemporaneamente, come il NGS (next generation sequencing), sta rivoluzionando il panorama della diagnostica molecolare. Già oggi, l’analisi in NGS può essere utilizzata nelle leucemie acute mieloidi per classificarle e decidere l’eventuale indicazione al trapianto allogenico di cellule staminali. Anche nelle neoplasie mieloproliferative croniche e nelle sindromi mielodisplastiche lo studio in NGS può essere effettuato in molti casi per poter applicare nuovi score prognostici, potenzialmente utili per guidare anche la scelta di terapie oppure, nella leucemia mieloide cronica, per identificare la presenza di mutazioni di BCR/ABL (responsabili della resistenza al trattamento in corso) e quindi indicazioni ad eventuali modifiche del farmaco. Inoltre, l’uso di tale metodica si sta espandendo in molte altre patologie e potrebbe diventare anche utile nel monitoraggio della malattia minima residua.
Tabella riassuntiva delle tecniche di analisi
| Tecnica | Obiettivo | Principio |
|---|---|---|
| Northern blot | Valutare l'espressione genica | Separazione dell'RNA per dimensione, ibridazione con sonda marcata |
| Real-time PCR (RT-PCR) | Valutare l'espressione genica | Amplificazione del cDNA con misurazione della fluorescenza in tempo reale |
| Western blot | Analisi dell'espressione proteica | Separazione delle proteine per dimensione, riconoscimento con anticorpi |
| ELISA | Analisi dell'espressione proteica (proteine solubili) | Riconoscimento della proteina con anticorpi e misurazione del cambiamento di colore |
| Citometria a flusso | Analisi dell'espressione proteica (proteine di membrana/solubili) | Misurazione della fluorescenza di cellule marcate con anticorpi |