Le proteine sono macromolecole indispensabili per l’esistenza degli esseri viventi, costituite da catene di amminoacidi. All’interno degli organismi, svolgono una vasta gamma di funzioni: dalla funzione plastica e strutturale, alla catalisi di reazioni chimiche all’interno delle cellule, alla generazione e modulazione delle risposte agli stimoli interni ed esterni, al trasporto di molecole da un luogo all’altro della cellula.
Tutte le proteine che conosciamo coinvolte nei processi biologici sono costituite dagli stessi 20 amminoacidi (22 includendo 2 ulteriori aminoacidi particolari che compaiono solo in particolari meccanismi di traduzione proteica), molecole organiche che si possono combinare tra loro per formare lunghe catene ripiegate. Ma la particolarità delle proteine non si esaurisce qui: quando gli amminoacidi si uniscono, le relazioni elettromagnetiche tra gli atomi che le compongono si modificano a causa delle rispettive interazioni, piegando la struttura della sequenza di amminoacidi per creare una determinata forma tridimensionale, che è strettamente legata al loro funzionamento.
“Sebbene le singole unità di cui sono composte - gli aminoacidi - siano solo 20, disposti in sequenze precise, in natura esistono milioni di proteine diverse, ognuna delle quali ha caratteristiche e funzioni differenti. Questo è possibile perché gli amminoacidi si arrangiano nello spazio in maniera diversa, a seconda delle loro caratteristiche chimiche: pertanto, a ogni sequenza di amminoacidi di cui è costituita una proteina, corrisponderà una struttura diversa.
Un concetto molto noto in biologia è quello del cosiddetto modello “lock-and-key”, secondo cui una proteina, per funzionare correttamente con un certo ligando, deve interagire con esso a livello strutturale, nello stesso modo in cui una chiave entra nella serratura. Trovare un farmaco o un vaccino che abbia un certo effetto su una proteina, quindi, è un po’ come trovare la giusta chiave per una serratura da aprire, o viceversa da chiudere o bloccare.
Il Folding delle Proteine
Il ripiegamento delle proteine, noto anche come "folding", è il processo attraverso il quale una catena polipeptidica acquisisce la sua struttura tridimensionale nativa. Questo meccanismo non è solo un ripiegamento della proteina, ma ne determina anche la funzione. Da qui nasce l’enorme interesse nel conoscere come gli amminoacidi si dispongono in una struttura spaziale.
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Per questo, fin dagli anni Settanta, i ricercatori hanno tentato a lungo di prevedere la struttura tridimensionale delle proteine a partire dalla loro sequenza di amminoacidi, ma questo si era rivelato pressoché impossibile. La capacità di predire quale struttura tridimensionale assumerà la proteina sulla base della sequenza di aminoacidi da cui è composta, secondo il processo del cosiddetto folding proteico, richiedeva l’applicazione di metodi sperimentali complessi, lunghi e costosi. D’altro canto, l’approccio computazionale forniva solo soluzioni limitate, fino all’avvento di AlphaFold 2.
Metodi di Studio e Struttura Covalente
Uno studio completo delle proprietà strutturali di una proteina comprende: 1) la sua caratterizzazione generale; 2) l'analisi della sequenza degli amminoacidi; 3) la determinazione della conformazione della proteina. Questi studi richiedono spesso quantità relativamente grandi di proteina purificata.
I due principali legami che si riscontrano nelle proteine sono il legame peptidico e il ponte disolfuro. Nel 1902 fu avanzata l'ipotesi che gli amminoacidi fossero uniti con legame peptidico. Mentre il legame peptidico è il mezzo per unire i vari amminoacidi a formare la catena polipeptidica, il ponte disolfuro tra due semiresidui di cistina serve a stabilizzare la struttura proteica; ciò viene realizzato congiungendo o differenti regioni della stessa catena polipeptidica (legame intracatena) o due differenti catene polipeptidiche (legame intercatene).
Purificazione e Caratterizzazione
La proteina studiata è spesso presente in piccole quantità (〈1%) in una miscela complessa di altre proteine con caratteristiche fisiche simili. Complica il problema il fatto che la purificazione dev'essere effettuata in condizioni blande, poiché valori estremi di temperatura, di pH e composizione del solvente spesso causano l'irreversibile denaturazione della proteina con conseguente perdita dell'attività biologica. Tutte queste difficoltà hanno portato allo sviluppo di tecniche di purificazione molto selettive.
Vi sono numerosi metodi per la determinazione del peso molecolare delle proteine. Nel 1923 fu costruita l'ultracentrifuga allo scopo di determinare il peso molecolare di macromolecole. Benché le proteine possano avere pesi molecolari di diversi milioni, le proteine più grandi sono in genere composte da subunità polipeptidiche più piccole; queste subunità hanno spesso un peso molecolare inferiore a 100.000 e sono tenute insieme da interazioni non covalenti o da ponti disolfuro.
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Le quantità relative di ciascun amminoacido in una proteina possono essere determinate dopo idrolisi completa della stessa. Oggi si adoperano largamente metodi automatici per l'analisi cromatografica degli amminoacidi: questi sono separati su di una resina polistirenica solfonata e determinati quantitativamente facendo reagire l'eluato con ninidrina, per formare un composto colorato: l'intensità del colore (assorbanza o estinzione) viene misurata e registrata automaticamente.
Sequenziamento degli Amminoacidi
La determinazione qualitativa e quantitativa degli amminoacidi ammino- e carbossi-terminali di una proteina non solo fornisce un'ulteriore informazione strutturale, ma può anche essere usata per determinare il numero di catene polipeptidiche che formano la proteina e per accertarne l'omogeneità.
Nel 1955 fu pubblicata la prima sequenza degli amminoacidi di una proteina a molecola relativamente piccola, l'ormone insulina: questo risultato è stato veramente una pietra miliare nello studio della struttura delle proteine, tanto più notevole se si considerano le tecniche relativamente primitive disponibili a quel tempo.
La purificazione della proteina comprende la separazione delle diverse subunità, l'apertura dei legami disolfuro e l'alchilazione dei residui di cisteina. Nell'ulteriore passaggio la catena polipeptidica viene spezzata in punti specifici, dando luogo a peptidi di cui si determina la sequenza; per spezzare la catena proteica si usano metodi chimici ed enzimatici. Il passaggio successivo comporta la separazione dei peptidi, ottenuti chimicamente o enzimaticamente, mediante l'uso della cromatografia a scambio ionico, della gelfiltrazione o dell'elettroforesi su carta.
AlphaFold e l'Intelligenza Artificiale
AlphaFold 2, l’ultimo sistema di intelligenza artificiale sviluppato da DeepMind, di proprietà di Google, ha compiuto un balzo enorme nel risolvere una delle più grandi sfide della biologia: determinare la forma 3D di una proteina dalla sua sequenza di amminoacidi. Il sistema potrebbe essere in grado di fornire almeno per una grande classe di proteine la struttura tridimensionale con una precisione abbastanza elevata per essere in grado di aprire il campo della biologia strutturale di diversi ordini di grandezza.
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Il suo metodo si basa su un programma di calcolo numerico chiamato Rosetta sviluppato inizialmente per lo scopo opposto, ossia prendere una sequenza di amminoacidi e calcolare con una buona approssimazione la sua struttura tridimensionale. Grazie a questo lavoro rivoluzionario, il programma è stato utilizzato in un numero incalcolabile di applicazioni nello studio delle proteine, dalla lotta alla resistenza dei batteri agli antibiotici, alla creazione di enzimi che possono degradare ed eliminare la plastica dall’ambiente.
Se c’è una cosa su cui i sistemi di intelligenza artificiale sono imbattibili, infatti, è di analizzare un’immensa mole di dati per trovare all’interno associazioni e ripetizioni per ricavare i loro schemi di base. Il modello prevede un approccio evolutivo: una volta presa in carico la sequenza di amminoacidi della proteina sconosciuta, il programma cerca al suo interno porzioni di catena associate a strutture proteiche simili e note; poi analizza queste porzioni (spesso appartenenti a proteine di specie diverse) e indaga quali parti sono state preservate durante il percorso evolutivo, alla ricerca di schemi ricorrenti.
Nella fase successiva, AlphaFold2 esplora quali amminoacidi possono interagire tra loro nella struttura tridimensionale della proteina, ricostruendo come sono cambiate le interazioni durante il percorso evolutivo. Il modello ipotizza di conseguenza una struttura proteica e, utilizzando un processo di iterazione, perfeziona la sequenza finale di amminoacidi per arrivare a una struttura tridimensionale stabile. Dopo un numero limitato di ripetizioni (in genere tre), il sistema converge verso una risposta finale con un’elevata probabilità di essere corretta.
Le potenzialità di questi nuovi strumenti sono inoltre destinate a rafforzarsi a vicenda: la possibilità di progettare nuove proteine attraverso metodi computazionali è aumentata esponenzialmente grazie alle capacità di previsione dell’intelligenza artificiale, rendendo estremamente più efficiente e produttivo il lavoro del gruppo di Baker e altri. Con l’introduzione di AlphaFold3 all’inizio di quest’anno, il modello inoltre non è più limitato alle proteine a singola catena, ma può anche prevedere la struttura di complessi proteici più ampi, accoppiati a molecole di DNA o RNA e altre modifiche specifiche.
Impatto e Applicazioni
Anche per sviluppare nuovi farmaci dobbiamo conoscere la struttura 3D delle proteine: la maggior parte dei farmaci, infatti, sono piccole molecole note come ligandi che si legano alle proteine per modificare il modo in cui esse funzionano in processi patologici.
Le proprietà e le funzioni delle molecole nei sistemi biologici sono tipicamente il risultato di come interagiscono con altre molecole. Le proteine interagiscono con altre proteine, con DNA/RNA, molecole, ioni ecc, che a loro volta interagiscono tra loro e con altre molecole ancora. I farmaci spesso agiscono non sulle singole proteine ma proprio su queste complesse interazioni biomolecolari.
In sostanza, se sappiamo che una proteina esegue una certa funzione - magari legata a una malattia - grazie all’interazione con un ligando (il meccanismo lock-and-key di prima), lo studio di questa interazione a livello strutturale ci potrebbe dire cose molto interessanti sulla funzione della proteina: per esempio dove entra la chiave, che forma deve avere e la forma di altre chiavi in grado di bloccare la serratura.
La previsione del folding proteico significa predire la funzione di nuove proteine e capire il malfunzionamento di altre che sono alla base di diverse malattie come nella malattia neurologiche (Alzheimer, Huntington e Parkinson) e in molti tipi di tumore.
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