L'analisi delle proteine è un campo cruciale della biochimica e della biologia molecolare. Tra i vari aspetti di tale analisi, troviamo quello dell’identificazione e del sequenziamento delle proteine.
Elettroforesi
L'elettroforesi è una tecnica fondamentale per la separazione delle proteine. In questa tecnica, una proteina, avendo una propria carica elettrica, viene fatta migrare in un campo elettrico. La separazione tramite questo metodo è possibile grazie alle proprietà fisiche delle proteine.
Il processo avviene in opportuni gel, come ad esempio il gel di poliacrilamide, e viene applicato un campo elettrico. In particolare, le proteine con carica positiva migreranno più lentamente se instaureranno delle interazioni con la fase stazionaria, o vice versa.
Cromatografia Ionica
La cromatografia ionica è un'altra tecnica di separazione basata sull'interazione tra le proteine e una fase stazionaria carica. Si utilizzano resine anioniche e scambiatrici cationiche, spesso a base di polistirene. Queste resine sono costituite da polimeri crociati e quindi insolubili che interagiscono con ioni. La separazione avviene in solventi appropriati.
Maggiore è l’ampiezza del picco, minore sarà l’efficienza della colonna utilizzata. Questo perché, in pratica, alcune molecole seguono percorsi tortuosi, lunghi rispetto ad altre che invece seguono percorsi più lineari. Questo genera una differenza nel passaggio all’interno di una colonna di vetro, come il gel di silice ODS.
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Spettrofotometria
La spettrofotometria è una tecnica che sfrutta l'assorbimento della luce da parte delle proteine. La luce è una parte di nuclei, atomi, molecole e la sua interazione con essi è dipendente dalla lunghezza d’onda. L'assorbimento della luce è possibile grazie ad alcuni gruppi funzionali necessari per poter spostare gli elettroni di questi composti. Questi gruppi funzionali sono chiamati cromofori.
La luce si propaga lungo l’asse t con un campo elettrico E e un campo magnetico B. Lo strumento utilizzato per misurare l'assorbimento della luce è chiamato spettrofotometro. L'analisi dei dati permette di identificare la lunghezza d’onda e di determinare l'abbondanza osservata nello spettro, fornendo informazioni sulla classe di composti a cui appartiene l’analita e sulle sue caratteristiche.
Spettrometria di Massa
La spettrometria di massa è una tecnica potente per determinare la massa molecolare delle proteine. Una delle tecniche utilizzate è la MALDI, in cui l'analita viene fatto assorbire luce (chiamata matrice) e viene posto in vuoto, che rappresenta un analizzatore. L'analita viene disperso sotto forma di micro gocce cariche, minimizzando i danni alla proteina. La collisione avviene con un gas inerte, frammentando il peptide in ioni. La differenza di massa tra gli ioni permette di dedurre il peso molecolare dell’analita e quindi la sua abbondanza.
Sequenziamento Proteico
Il sequenziamento proteico è il processo di determinazione della sequenza amminoacidica di una proteina. Questo processo può iniziare con la reazione del residuo -NH2 (chiamato N-terminale) con dei reagenti, lasciando intatta l’intera catena e ottenendo l’identificazione degli amminoacidi marcati. È possibile purificare ogni singolo frammento ottenuto con il sequenziatore.
Se due campioni di proteina provengono da laboratori differenti, il sequenziamento può rivelare se si tratta dello stesso tipo di proteina. Tuttavia, è importante considerare che modificazioni post-traduzionali, come la fosforilazione o la glicolisazione, possono influenzare i risultati. L’insieme di tipi di ioni verrà chiamato Δ. P è stato frammentato in Pi nello stesso modo.
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Analisi Dettagliata degli Ioni
Durante l'analisi, si considerano diversi tipi di ioni e le loro caratteristiche. Ad esempio, la perdita di ammoniaca (17 dalton) o altri gruppi chimici da un frammento peptidico. L’insieme di tipi di ioni verrà chiamato Δ. P è stato frammentato in Pi nello stesso modo.
Per identificare il peptide, si costruisce un grafo dallo spettro sperimentale e si confronta con gli spettri teorici della sequenza. Si tiene conto del momento degli ioni dei C-terminali. Si cerca nello spettro sperimentale ione da Δ = {δ1, ... alcuni peptidi parziali e 1 ≤ j ≤ k. ... , s + δk. ogni possibile tipo di ione etichettato con massa s + δi per la massa di un singolo aminoacido. N-terminali regolato dal tipo di ione δj. + δ1, ... sj sono vicini. = m. più qk + 2 vertici. differenza tra le masse del vertice aminoacido che etichetteremo come (u,v) per ogni 1 ≤ i ≤ n. dello spettro che è etichettato da P.
Inoltre, si valutano le probabilità associate a ciascun ione e si considerano gli ioni parziali. La determinazione della sequenza può presentare delle ambiguità, che richiedono l'uso di database e algoritmi di ricerca avanzati.
La tecnica dell’ SPC (Shared Peak Count) è un metodo utilizzato per valutare la similarità di sequenza. Si confronta lo spettro teorico del peptide presente nel database con lo spettro sperimentale. Si identificano coppie di picchi (S1, S2) tali che s2 - s1 = x, dove x=0 e x=δ. Si calcola il numero di picchi in comune tra i due spettri. Questo metodo è particolarmente utile per identificare mutazioni o modificazioni post-traduzionali.
Infine, si utilizzano algoritmi di programmazione dinamica, come l'algoritmo di Manhattan, per confrontare gli spettri e identificare le regioni di similarità. Questo approccio permette di gestire le complessità associate alle mutazioni e alle variazioni nella sequenza peptidica.
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| Spettro | Picchi | Picchi Comuni |
|---|---|---|
| Spettro Teorico (P1) | a1, a2, a3, a4, a5, a6 | - |
| Spettro Sperimentale (P2) | a1, a2, a3, b4, b5, a6 | a1, a2, a3, a6 |
| SPC | - | 4 |