I progetti di sequenziamento dei genomi hanno posto le basi per lo studio dei fenomeni biologici con metodologie globali, in genere descritte dal suffisso -omica. Lo studio della globalità delle proteine, nella loro attualità funzionale, viene comunemente indicato con la denominazione di proteomica.
Si riconosce al ricercatore australiano M. Wilkins il merito di aver coniato nel 1994 il vocabolo proteoma, un acronimo di proteine e genoma, volendo con tale vocabolo intendere il complemento proteico espresso da un genoma, cioè l'intero complesso dei prodotti dell'espressione di un genoma.
Il proteoma ha un significato dinamico, a differenza del concetto statico di genoma, poiché in corrispondenza di stimoli, interni o esterni alla cellula, i prodotti dell'espressione del genoma possono notevolmente variare; pertanto si può affermare che a un genoma corrisponda una molteplicità di proteomi il cui limite superiore, almeno per ora, non è definibile.
È importante sottolineare come la regolazione dell'espressione genica, nella sua eccezionale capacità di modulazione, rappresenti un continuo che si estende per almeno nove ordini di grandezza; ne discende che una singola proteina in un proteoma può essere differentemente rappresentata da una a un miliardo di volte.
La proteomica, pertanto, può essere definita come lo studio, nella loro complessità, dei proteomi. Da questa definizione di carattere del tutto generale discendono varie altre definizioni di proteomica che, opportunamente specificate o aggettivate, si riferiscono agli obiettivi specifici che l'approccio proteomico intende affrontare. Questi obiettivi possono riguardare gli aspetti meramente strutturali (proteomica strutturale) oppure quelli funzionali (proteomica funzionale).
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Naturalmente non sarebbe possibile affrontare questo tipo di studi senza la disponibilità delle banche dati genomiche e dei mezzi informatici che ne consentono la consultazione e, soprattutto, senza lo sviluppo di tecnologie e metodologie sofisticate di separazione e di identificazione delle proteine.
Metodologie della Proteomica
La proteomica si basa essenzialmente su due differenti passaggi analitici consecutivi costituiti dalla separazione delle proteine che costituiscono il proteoma e dalla loro successiva identificazione individuale. I primi studi, ora definibili di proteomica, si possono far risalire alla metà degli anni Settanta del 20° sec., quando, utilizzando la tecnica dell'elettroforesi bidimensionale, fu possibile ottenere una mappa dell'insieme delle proteine presenti in cellule sia procariotiche sia eucariotiche.
Tuttavia, non erano in quel momento disponibili sistemi altrettanto efficienti e sensibili per l'identificazione delle proteine stesse né, d'altra parte, erano disponibili banche dati di sequenza di una certa consistenza. Solo dopo tre lustri furono messi a punto metodi di sequenziamento a livello subnanomolare delle bande proteiche mediante l'impiego del sequenziatore in fase gassosa.
La nascita della moderna proteomica, pertanto, si può far risalire alla possibilità d'accesso a queste informazioni conseguenti al sequenziamento dei genomi. Successivamente l'evoluzione, della spettrometria di massa ha radicalmente cambiato i tempi e i metodi d'analisi dei proteomi.
Elettroforesi Bidimensionale (2DE)
L'elettroforesi bidimensionale è una tecnica di separazione ortogonale che sfrutta essenzialmente le due principali caratteristiche delle proteine, ossia la carica netta valutata in termini di punto isoelettrico (pI) e la grandezza molecolare valutata in termini di peso molecolare (Mw).
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Nella 2DE si utilizza nella prima dimensione la separazione in funzione del punto isoelettrico e, quindi, si sottopongono le proteine così frazionate all'ulteriore processo elettroforetico ortogonale in presenza di sodio dodecilsolfato (SDS), che separa le proteine in funzione del peso molecolare. Le proteine vengono evidenziate come macchie per trattamento del gel con sistemi di colorazione (blu di Comassie, argento o oro colloidale, coloranti fluorescenti) e descrivono una complessa mappa elettroforetica in funzione delle due coordinate, Mw e pI.
Tuttavia, l'introduzione dei gradienti immobilizzati di pH nella prima dimensione ha consentito non solo di ottenere una riproducibilità notevolmente maggiore, ma anche di coprire intervalli di pH più ampi (pH 3 - 12) di quelli ottenibili con gli anfoliti in soluzione, di utilizzare una maggiore quantità di proteine senza disturbare il gradiente di pH, di ottenere separazioni in intervalli estremamente ristretti di pH (fino a un'unità di pH) e, conseguentemente, un'alta risoluzione nella prima dimensione.
Mediante l'impiego di reattivi-rivelatori con diversa fluorescenza, è stato introdotto un protocollo sperimentale innovativo che prende il nome di DIGE (DIfference Gel Electrophoresis) e prevede la separazione su un unico gel di due diversi proteomi che sono stati fatti reagire con due diversi marcatori fluorescenti. In questo modo vengono individuate direttamente e immediatamente le macchie da sottoporre all'analisi per l'identificazione delle proteine e che caratterizzano uno dei due proteomi.
Spettrometria di Massa per l'Identificazione delle Proteine
L'identificazione di una proteina mediante spettrometria di massa avviene attraverso l'analisi dei peptidi generati utilizzando proteasi specifiche (tripsina, Asp-N proteinasi, Glu-C proteinasi). In questo caso, tuttavia, i peptidi sono caratterizzati non più dai loro parametri chimico-fisici come polielettroliti, ma più semplicemente dalla loro massa attraverso la determinazione, effettuata dallo spettrometro di massa, dei loro pesi molecolari.
Il principio dell'identificazione delle proteine mediante l'utilizzo della spettrometria di massa è abbastanza semplice e si basa sull'osservazione che proteine con una diversa sequenza aminoacidica, in seguito all'azione di una proteasi specifica, generano un insieme discreto di peptidi, definiti dalla loro massa, che è unico per quella proteina.
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In particolare, la banda proteica di un gel bidimensionale, la cui colorazione è condotta in condizioni da non interferire con la successiva analisi, viene direttamente trattata con proteasi (analisi in-gel) generando una miscela di peptidi. La miscela peptidica viene direttamente esaminata con lo spettrometro di massa, ottimizzando la procedura analitica per ottenere il maggior numero di segnali che consentano di valutare con la massima accuratezza possibile, anche in relazione alla strumentazione disponibile, i valori delle masse degli ioni molecolari.
Per questo tipo di analisi è utilizzato come sistema di ionizzazione il MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization), in cui si sfrutta la radiazione laser per indurre la produzione di ioni molecolari protonati degli analiti opportunamente incorporati in matrici di natura organica. Di solito le sorgenti MALDI sono accoppiate con analizzatori a tempo di volo (TOF, Time of Flight), che misurano il rapporto massa/carica degli ioni generati nella sorgente sulla base del tempo che questi impiegano nel percorrere uno spazio definito in assenza di campi elettrici e magnetici. Con questi apparecchi, purché dotati di particolari accorgimenti per evitare dispersioni di energia degli ioni, si riesce a ottenere una misura delle masse dei peptidi con un'accuratezza alla seconda cifra decimale.
Una limitazione intrinseca di tale metodologia è dovuta al fatto che, per effetto di permutazioni nella sequenza aminoacidica, si possono ottenere più specie molecolari isobariche, ossia che a un valore di massa anche notevolmente accurato possano corrispondere una molteplicità di peptidi. Tuttavia, i peptidi isobari sono comunque dotati di differenti successioni degli aminoacidi che li costituiscono.
Utilizzando spettrometri di massa dotati di un secondo analizzatore, è possibile ottenere uno spettro di massa dei frammenti dei peptidi separati con il primo analizzatore e, quindi, dallo spettro di frammentazione risalire alla sequenza aminoacidica.
Gli spettri di frammentazione si possono far risalire a frammentazioni statistiche del legame ammidico con la conseguente generazione di due serie di ioni che ritengono la carica o sulla parte N-terminale (ioni di tipo b) o su quella C-terminale (ioni di tipo y).
Gli spettrometri ES-nanospray con i doppi analizzatori, in particolare quadrupolo e a tempo di volo ortogonale, collegati a un cromatografo capillare, hanno rivoluzionato la pur breve storia della proteomica.
La Proteomica di Seconda Generazione
La proteomica di seconda generazione nasce dall'osservazione che, invece di separare le proteine e quindi ottenere poi da ciascuna banda separata i peptidi da analizzare, il sistema possa essere reso più efficiente sottoponendo a proteolisi (per es., con tripsina) l'intero proteoma di un sistema cellulare o di una frazione subcellulare e, dopo separazione cromatografica, sequenziare direttamente i peptidi con uno spettrometro di massa del tipo descritto.
In questo modo viene apparentemente esasperato il problema analitico, giacché la complessità della miscela da separare aumenta di almeno un ordine di grandezza. Tuttavia, è possibile sfruttare il potere risolutivo della cromatografia capillare (in qualche caso è stata impiegata anche l'elettroforesi capillare), che risulta molto più elevato di quello dell'elettroforesi bidimensionale.
L'approccio metodologico che ha avuto il maggiore successo consiste nell'impiego di un sistema cromatografico capillare multidimensionale che combina la separazione a scambio ionico con quella su fase inversa, e di una potente piattaforma informatica per la ricostruzione della sequenza dei peptidi dagli spettri di frammentazione e per l'interrogazione delle banche dati.
Una metodologia innovativa, intesa anche a rispondere alle problematiche quantitative della proteomica differenziale, è stata proposta da R. Aebersold e dai suoi collaboratori (Gygi, Rist, Gerber et al. 1999). Tale metodologia si basa sull'utilizzo di una molecola che è stata denominata Isotope Coded Affinity Tag, conosciuta con l'acronimo ICAT.
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