La biologia cellulare affonda le sue radici nella citologia e nell’istologia del XIX secolo, e nel corso del Novecento si concentra sulle strutture intracellulari e sui processi fisiologici che sono alla base della vita della cellula e delle sue specializzazioni. Se la biochimica e la biologia molecolare cercano spiegazioni chimico-fisiche, la biologia cellulare affronta lo studio della vita a livello di organizzazione sovramolecolare: le assemblee molecolari come le membrane e gli organelli, studiate a livello di struttura, biogenesi e funzione, le linee cellulari e la differenziazione cellulare nel corso dello sviluppo. Nel Novecento la maggior parte della fisiologia diventa cellulare, così i biologi cellulari si interessano di metabolismo, elettrofisiologia e farmacologia in quanto fenomenologie definibili a livello di proprietà della cellula. Studi, come quelli sulla respirazione, sulla permeabilità delle membrane o sulla tossicità dei farmaci vengono condotti su singole cellule con risultati soddisfacenti.
Sviluppi nelle Tecniche di Coltura Cellulare
La prima tecnica è messa a punto nel 1935 da Ross Harrison e Alexis Carrel, che sviluppano un metodo per mantenere in vita piccole quantità di tessuto per lunghi periodi all’interno di un grumo di plasma immerso in una soluzione nutriente. Questo metodo, noto come coltura di tessuti, riguarda frammenti di tessuto e cellule indipendenti e consente sia lo studio, sia la manipolazione sperimentale della soluzione nutriente, sia l’analisi di ciò che serve per la crescita cellulare e la relativa differenziazione, sia l’esame sperimentale degli effetti degli ormoni, dei farmaci e delle tossine. Utilizzando la microfotografia a intervalli temporali, si giunge a studi sulla divisione e i movimenti cellulari e sulle interazioni tra le cellule.
Con queste metodologie si è arrivati a scoprire le linee cellulari, da cui è evoluto il concetto di cellula staminale che, in quanto meno differenziata, si può dividere asimmetricamente per produrre una cellula staminale autopropagantesi così come un’ulteriore cellula figlia più differenziata. Dagli anni Cinquanta in poi numerosi ricercatori sviluppano metodi per disaggregare i tessuti in cellule singole e per produrre colture di quest’ultime. Theodore Puck e i suoi colleghi dimostrano che tali cellule, se metabolicamente supportate con strati di nutrizione irradiati letalmente (ossia da cellule metabolicamente attive che vengono irradiate così che non siano in grado di riprodursi), formano colonie di cloni.
Nascita della Biologia Cellulare Moderna
Generalmente si fa risalire l’inizio dell’era moderna della biologia cellulare alla nascita di una scuola di biologia cellulare sorta all’interno del dipartimento di patologia del Rockefeller Institute for Medical Research. Vi giunge, nel 1929, Albert Claude che, insieme a Keith Porter, arrivato nel 1939, utilizzerà per le proprie ricerche l’ultracentrifuga, con cui era possibile frazionare i campioni nelle parti che li compongono, e il microscopio elettronico: due strumenti da poco inventati. Insieme scoprono il reticolo endoplasmatico, il complesso sistema di membrane cellulari formato da vescicole, tubuli e canalicoli che consente il passaggio delle sostanze. Nel 1946 George Palade si unisce al gruppo e sviluppa nuovi metodi per lo studio del reticolo endoplasmatico e delle sue funzioni. Grazie alla combinazione di analisi biochimica dei frammenti e del loro esame morfologico al microscopio elettronico, il gruppo Rockefeller ha mappato le funzioni biochimiche a livello delle caratteristiche strutturali delle cellule, elaborando una isto-citochimica degli enzimi che permette di localizzare la presenza di specifiche attività enzimatiche e spiega gli aspetti funzionali e strutturali dell’apparato di Golgi, così come quelli dei mitocondri, gli organuli responsabili della produzione energetica.
Sintesi, Processazione e Secrezione delle Proteine
I biologi cellulari hanno messo insieme studi di morfologia e fisiologia cellulare per capire come le cellule sintetizzano, processano e secernono le proteine. Finché molte proteine cellulari rimangono all’interno della cellula, alcune proteine importanti come anticorpi, enzimi digestivi, ormoni peptidici e altre molecole usate per la comunicazione intercellulare, devono in qualche modo spostarsi dall’interno della cellula alla sua superficie esterna nel flusso sanguigno o nel fluido intercellulare. Negli anni Sessanta e Settanta vengono scoperte le principali modificazioni nella sintesi e nella postsintesi delle proteine, quali le proteasi del pancreas e le immunoglobuline dei linfociti. Dopo la sintesi, da parte dei ribosomi, sotto la direzione dell’RNA messaggero, le molecole proteiche che sono destinate alla secrezione esterna vengono inserite nel reticolo endoplasmatico, dove le proteine sono modificate attraverso l’addizione di zuccheri e lipidi. Queste proteine passano poi all’apparato di Golgi, dove avvengono le modificazioni finali necessarie alle cellule per indirizzare le proteine verso la loro localizzazione finale, intra o extra cellulare. Le proteine che sono destinate a essere emesse, come gli enzimi digestivi, vengono raccolte all’interno di piccole sacche membranose, chiamate vescicole che si fondono con la membrana esterna della cellula e rovesciano il loro contenuto all’esterno della cellula.
Leggi anche: Scopri Klotho
Comunicazione e Integrazione Cellulare
Nel 1901 William Bayliss (1860-1924) e Ernest Starling danno la prima dimostrazione dell’esistenza di effettori chimici endogeni in grado di innescare e regolare risposte fisiologiche organizzate, dimostrando che la secrezione pancreatica può essere indotta da una somministrazione di estratto di mucosa duodenale, sostanza attiva che chiamano secretina. Nel 1905 si propone il concetto di ormone (dal greco hormôn, che eccita) come messaggero ed effettore chimico “trasportato dagli organi dove esso viene prodotto agli organi su cui agisce per mezzo del sangue”, prefigurando la problematica della comunicazione e dell’integrazione cellulare su cui opererà la ricerca endocrinologica, ma anche la biologia cellulare.
Tra il 1948 e il 1952 Rita Levi Montalcini ipotizza e dimostra l’esistenza in alcuni tumori di un fattore biochimico in grado di stimolare la crescita dei nervi. I segnali dall’esterno all’interno della cellula non richiedono un supporto fisico per trasportare il segnale molecolare attraverso la membrana cellulare, che invece è mediato dal recettore transmembranale che segnala la proteina. Si tratta del concetto di trasduzione dei segnali basato sul legame del “primo messaggero” con il dominio esterno della proteina transmembranale. Questa proteina, presumibilmente indotta dal legame con il “primo messaggero” a cambiare la sua forma, attiva il dominio interno della proteina per sintetizzare il “secondo messaggero” che agisce dentro la cellula. Questo modello di comunicazione tra le cellule è risultato molto fruttuoso e ha consentito la comprensione dell’azione di numerose molecole di regolazione, fisiologicamente importanti. Martin Rodbell e i suoi colleghi scoprono tra il 1971 e il 1975 che il comune meccanismo per questo percorso di segnalamento transmembranale coinvolge una famiglia di proteine intercellulari che sono regolate attraverso un legame con la guanosina trifosfato (GTP) e la guanosina di fosfato (GDP), e che quindi sono chiamate proteine G.
Struttura e Funzione delle Membrane Cellulari
Nel corso dell’ultimo decennio dell’Ottocento Ernest Overton sviluppa l’ipotesi che l’involucro delle cellule sia una membrana lipoide. Nel 1935 Hugh Davson e James Frederic Danielli propongono un modello di membrana composta di due strati di fosfolipidi compressi, con entrambi i lati della membrana rivestiti da numerose molecole di proteine, ancorate sulla superficie del doppio strato lipidico. Nel 1945 viene messa a punto (e nel 1976 migliorata) la tecnica del voltage clamp utilizzata per studiare le correnti ioniche macroscopiche nei neuroni e attraverso la quale è possibile analizzare il comportamento di una membrana che contiene numerosi canali. La capacità delle proteine di discriminare tra sostanze sulla base della carica, oltre che delle dimensioni e della struttura, si rivelerà essenziale nella comprensione dei processi di trasporto attraverso le membrane. La prima micrografia elettronica ad alta risoluzione di una membrana biologia, quella dei mitocondri, viene ottenuta nel 1952 da George Palade; mentre 10 anni dopo viene messo a punto il primo doppio strato lipidico artificiale che simula una membrana cellulare. Il modello di Davson e Danielli viene sostituito nel 1970 da quello proposto da Jonathan Singer e Garth Nicolson, il modello a mosaico fluido. Quest’ultimo, più compatibile con i dati più recenti, prevede che le proteine siano integrate nella membrana, che possano muoversi al suo interno e che alcune possano attraversare l’intera membrana e sporgere su entrambi i lati della membrana.
Nel corso dell’ultimo decennio i dati sperimentali hanno portato all’ipotesi che la membrana cellulare sia organizzata in domini lipidici, ovvero in zattere lipidiche ricche di colesterolo e sfingolipidi, che incorporano le proteine di membrana. Le zattere lipidiche funzionerebbero come piattaforme di segnalazione che mediano le interazioni comunicative della cellula con l’ambiente circostante. La prima proteina integrata alla membrana cellulare a essere sequenziata è stata la glicoforina, nel 1975. L’attenzione rivolta alla membrana cellulare ha anche permesso di capire meglio fenomeni propri dei flussi di ioni, della conduzione nervosa e della trasmissione sinaptica a livello cellulare. La conoscenza delle proteine che si estendono sulla membrana cellulare conduce alla spiegazione della base fisica per il movimento di molecole attraverso le membrane cellulari per via di canali molecolari e pori, così come di speciali proteine per il trasporto di molecole come lo zucchero, e ioni come protoni e chloride, in entrambe le direzioni.
Resistenza delle Piante ai Patogeni e Proteine PR-10
La resistenza delle piante ai patogeni è un fenomeno complesso, alla cui espressione partecipano numerosi aspetti del metabolismo primario e secondario. Alcuni gruppi di ricerca nel mondo si stanno occupando di caratterizzare più a fondo il processo infettivo di P. viticola su vite e di definire i determinanti della resistenza, presenti in genotipi selvatici delle Vitaceae. Un'analisi su larga scala delle alterazioni trascrizionali associate al processo infettivo di P. viticola è stata recentemente svolta dal nostro gruppo di ricerca, mediante microarray analizzando i tempi più precoci dell'interazione (12 e 24 ore) sia in V. vinifera, suscettibile, che in V. riparia, resistente.
Leggi anche: Proteina Spike: dettagli
Funzioni delle Proteine PR-10
Le PR-10 sono relativamente abbondanti nelle piante, in cui sembrano svolgere diversi ruoli. Possono avere attività ribonucleasica e antimicrobica, sembrano rivestire ruoli nel metabolismo secondario e nella risposta allo stress, possono fungere da serbatoi di citochinine nella cellula. Accumuli di PR-10 o del relativo trascritto sono stati osservati in risposta a patogeni diversi. Poiché la famiglia annovera, in alcune specie, noti componenti allergenici del polline, la caratterizzazione della loro presenza e del loro ruolo nelle specie coltivate riveste una notevole importanza. Non è noto attualmente se e in che misura la resistenza a P.
L'attribuzione di un effettivo ruolo biologico ad una proteina attraverso analisi genetiche funzionali, è al momento di non facile realizzazione in vite, a causa delle difficoltà nella trasformazione genetica. Per superare queste limitazioni esiste la possibilità di intraprendere con altre metodiche esperimenti di "loss-of-function", ad esempio mediante attivazione diretta di un silenziamento genico post-trascrizionale, mediato dalla somministrazione esogena di piccoli RNA prodotti in vitro.
Obiettivi del Progetto di Ricerca sulle Proteine PR-10
Il progetto proposto è finalizzato alla caratterizzazione delle proteine di patogenesi PR-10 in vite ed alla definizione del loro eventuale ruolo nella resistenza nei confronti di P. Gli obiettivi specifici includono:
- analisi dell'espressione genica di tutti i membri della famiglia delle PR-10 di vite, in risposta a P. viticola: mediante analisi bioinformatica si cercherà di identificare tutte le sequenze di vite appartenenti alla famiglia delle proteine di patogenesi PR-10 e, attraverso primers specifici, saranno svolte analisi di espressione genica di ciascun membro mediante Real-time RT-PCR, su campioni di vite resistenti e suscettibili sottoposti ad infezione con P.
Analisi Funzionale della Proteina PR-10.1
La proteina PR-10.1, che da analisi trascrizionali appare fortemente indotta in genotipi resistenti in risposta alle infezioni con P. viticola, verrà espressa in vitro in E. coli. La proteina purificata sarà impiegata per:
- valutarne l'attività ribonucleasica in vitro,
- valutarne l'attività antiperonosporica in vivo
- produrre anticorpi policlonali, che saranno impiegati dall'Unità Operativa MILANO, per analisi di localizzazione istologica e citologica nel corso delle infezioni di P.
Silenziamento Genico Post-Trascrizionale
Per approfondire l'analisi della funzione delle PR-10 nella risposta a P. viticola, saranno svolti esperimenti di attivazione di silenziamento genico post-trascrizionale, tramite somministrazione esogena di RNA a doppio filamento corrispondenti a porzioni di sequenza conservate tra le PR-10 individuate in vite e anche tramite trasformazione via Agrobacterium rhizogenes con costrutti esprimenti hpRNA. Nell'ipotesi che le PR-10 abbiano un ruolo rilevante nella resistenza a P.
Leggi anche: Il segreto della longevità
Attivatori di C14orf152: Un Approccio Innovativo
Gli attivatori C14orf152 sono un gruppo specializzato di composti chimici progettati per aumentare l'attività della proteina codificata dal gene C14orf152, un locus sul cromosoma 14 descritto come una cornice di lettura aperta (orf) con l'identificatore 152. Come per molti geni identificati con questa nomenclatura sistematica, le funzioni precise della proteina C14orf152 possono essere oscure, tuttavia gli attivatori mirano specificamente a questa proteina per potenziarne l'attività biologica naturale. Questi attivatori chimici potrebbero interagire direttamente con la proteina, magari nel suo sito attivo, per facilitarne l'attività intrinseca, oppure potrebbero legarsi a siti regolatori secondari, determinando cambiamenti conformazionali che portano a un aumento dell'attività della proteina. Gli sforzi scientifici per sviluppare attivatori di C14orf152 si basano su una profonda comprensione della struttura della proteina, del ruolo che svolge nel contesto cellulare e dei meccanismi attraverso i quali esercita la sua funzione.
Il processo di creazione di attivatori di C14orf152 inizia con una ricerca completa per chiarire il ruolo biologico della proteina, che comporta lo studio dei modelli di espressione del gene C14orf152 in vari tessuti, la determinazione della sua localizzazione cellulare e l'identificazione di eventuali partner interagenti. Questo lavoro fondamentale spesso impiega tecniche come la profilazione dell'espressione genica, la microscopia a fluorescenza per la localizzazione della proteina e la co-immunoprecipitazione per rilevare le interazioni proteina-proteina. Una volta compreso il suo ruolo cellulare, l'attenzione si sposta sulla struttura della proteina. La determinazione della struttura tridimensionale della proteina è fondamentale per identificare i potenziali siti di legame per i composti attivatori. Per ottenere dati strutturali ad alta risoluzione si possono utilizzare tecniche come la cristallografia a raggi X, la microscopia crioelettronica o la spettroscopia NMR. Con le conoscenze strutturali in mano, gli scienziati possono poi utilizzare strumenti di chimica computazionale per simulare il modo in cui le piccole molecole potrebbero interagire con la proteina. Questi modelli computazionali possono guidare la progettazione di librerie chimiche e aiutare nello screening delle molecole che si dimostrano promettenti nel legarsi alla C14orf152 e attivarla. Dopo aver identificato i potenziali attivatori attraverso i metodi computazionali, questi composti vengono sintetizzati e testati in vitro. Vengono quindi condotti diversi saggi biochimici per valutare l'impatto dei composti attivatori sull'attività della proteina C14orf152.
Esempi di Attivatori C14orf152
I comuni attivatori del C14orf152 includono, ma non solo, (-)-Epigallocatechina gallato CAS 989-51-5, Resveratrolo CAS 501-36-0, Curcumina CAS 458-37-7, D,L-Sulforafano CAS 4478-93-7 e Colecalciferolo CAS 67-97-0.
Trasduzione del Segnale e Fosforilazione delle Proteine
Cell signaling, or signal transduction, is the process by which information from the cell surface is transmitted to the nucleus via a complex network of interwoven signaling cascades. Signal transduction cascades are generally triggered by the binding of ligands, such as growth factors, cytokines, neurotransmitters, or hormones, to a receptor. The propagation of the primary signal involves a wide array of enzymes with specialized functions. In many cases, the signal is propagated by post-translational modification of proteins. Protein phosphorylation, one of the most common post-translational modifications, plays a dominant role in almost all signaling events. Protein kinases and phosphatases are responsible for determining the phosphorylation state of cellular proteins and, thus, whether a signal gets transduced within a cell. Assays to detect the activity of kinases and other signaling enzymes are fundamental tools for researchers studying a wide variety of signaling events.
tags: #proteina #pr #localizzazione #cellulare