Le proteine, sintetizzate come catene polipeptidiche che si estendono in modo spazialmente non strutturato, devono raggiungere una conformazione tridimensionale stabile per poter svolgere le loro funzioni biologiche. L'insieme delle modifiche conformazionali che in una proteina caratterizzano i passaggi da una struttura lineare a una struttura tridimensionale è denominato 'folding' (ripiegamento).
Informazioni Genetiche e Conformazione Proteica
Da decenni è noto che tutte le informazioni necessarie a un polipeptide denaturato per il raggiungimento di una conformazione stabile e funzionale sono contenute all'interno della sua stessa sequenza amminoacidica. In teoria, quindi, la conformazione biologicamente attiva di una proteina dovrebbe essere desumibile una volta che sia nota la sua struttura primaria. In pratica, però, sono ancora ignote le regole che ci permetterebbero di predire la conformazione spaziale di una proteina a partire dalla conoscenza della sequenza lineare dei suoi amminoacidi.
Meccanismi del Folding Proteico
La comprensione dei meccanismi utilizzati dai polipeptidi per raggiungere una struttura tridimensionale che li renda in grado di svolgere correttamente le loro funzioni biologiche è stata in questi ultimi anni notevolmente favorita da numerosi studi sulla chimica fisica e sulla biologia cellulare di questo processo. Sebbene la conoscenza di tale argomento sia lontana dall'essere completa, è, tuttavia, opinione generale che il folding proceda attraverso molteplici passaggi distinti. Durante questo processo biologico altamente complesso si devono infatti formare e rompere numerose interazioni all'interno della catena polipeptidica in fase di ripiegamento e, in vivo, tra essa e gli enzimi e le proteine che facilitano questo processo.
Dopo la spiegazione del ruolo del codice genetico, lo studio del folding delle proteine favorirà notevolmente la comprensione del modo in cui la natura riesce a trasformare l'informazione genetica monodimensionale in strutture biologiche specifiche.
Stati Intermedi del Folding
Si ritiene che il refolding in vitro avvenga attraverso diverse vie che coinvolgono uno o più stati intermedi di folding relativamente stabili. Questi ultimi sembrano trovarsi in un equilibrio rapido con lo stato di denaturazione completa (nell'ordine di millisecondi), mentre sono convertiti allo stato nativo solo molto lentamente. Si ritiene che la conversione degli intermedi di folding nello stato nativo sia un processo cooperativo in cui il verificarsi di un'interazione rende stabile la successiva, che a sua volta stabilizzerà la prima interazione.
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La semplice via lineare di folding che procede attraverso la formazione di una serie di intermedi, uno successivo all'altro, potrebbe non essere applicabile alla maggior parte dei polipeptidi. Esistono varie prove dell'esistenza di vie di folding multiple e indipendenti. Secondo questa ipotesi, il folding di una proteina denaturata potrebbe avvenire attraverso vie distinte e parallele che comportano l'insorgenza di forme intermedie diverse ma che portano a un unico stato nativo ben definito. È sorto il dubbio che gli intermedi osservati non rappresentino stati reali del folding, ma che siano invece prodotti di reazioni collaterali non produttive che non conducono allo stato nativo.
Stato di Prefolding: Random Coil
Idealmente lo stato privo di folding è il cosiddetto random coil (catena attorcigliata a caso), in cui le conformazioni possibili, anche per una proteina di piccole dimensioni, sono moltissime. In questa fase il polipeptide si dovrebbe trovare in uno stato in cui la sua catena è molto estesa nello spazio e le interazioni non covalenti, che normalmente stabilizzano lo stato nativo, sono inesistenti.
È lecito supporre che le proteine, sintetizzate come polipeptidi lineari sui ribosomi, in vivo comincino il folding durante la loro stessa sintesi. Tuttavia evidenze sperimentali suggeriscono che le proteine destinate a essere veicolate a particolari compartimenti cellulari, quali cloroplasti, mitocondri e reticolo endoplasmatico, passino attraverso le membrane intracellulari in una conformazione estesa o con folding lasso.
Strutture Globulari Semisolide (Molten Globule)
È stato osservato che molte proteine, in certe condizioni, si trovano in una conformazione stabile che non è di folding compiuto, ma neanche di completa disorganizzazione sterica. Il verificarsi di conformazioni globulari semisolide (molten globule) è ben documentato. Le proprietà caratteristiche di tali strutture sono:
- La maggior compattezza rispetto allo stato di random coil e la dimensione lievemente maggiore rispetto alla proteina nativa.
- Un contenuto in strutture secondarie simile a quello della proteina con folding completo.
- La presenza di superfici idrofobiche esposte all'esterno, che le rendono suscettibili di aggregazione reciproca.
- Un'entalpia pressoché identica a quella che esse stesse hanno in uno stato privo di folding.
- Un'interconversione, dalla condizione di strutture globulari semisolide allo stato di completa disorganizzazione sterica, rapida e non cooperativa, e invece passaggio allo stato di folding completo lento e cooperativo.
Queste osservazioni suggeriscono che la struttura globulare semisolida sia una molecola collassata, dotata di strutture secondarie simili a quelle della corrispondente proteina nativa, ma priva di strutture terziarie stabili.
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Stato Nativo
Lo stato nativo di molte proteine diverse è stato esaminato con la cristallografia a raggi X e con l'analisi spettroscopica NMR. Questi studi hanno chiarito alcuni aspetti generali delle proteine globulari il cui folding sia avvenuto compiutamente e che si trovano quindi nello stato nativo. La caratteristica che accomuna tutte queste proteine globulari è la non polarità delle catene laterali che formano la parte interna della struttura e la generale prevalenza di catene laterali idrofiliche esposte alla superficie.
Per la maggior parte delle proteine non si conosce che un unico stato di folding completo.
Fattori che Influenzano il Folding Proteico in vivo
Gli esperimenti in vitro hanno sicuramente un valore significativo nel definire i tipi di interazioni intramolecolari che guidano il folding delle proteine, ma non riflettono accuratamente i processi di folding delle proteine nascenti all'interno della cellula. Le proteine non completamente strutturate, o in stati intermedi di folding, tendono a esporre superfici idrofobiche all'ambiente acquoso circostante e sono quindi particolarmente inclini all'aggregazione. In vivo la temperatura fisiologica e l'alta concentrazione sia delle proteine totali sia dei polipeptidi non strutturati favoriranno di gran lunga le interazioni improduttive di aggregazione rispetto alla via di folding corretta.
Un'ulteriore differenza tra il folding delle proteine in vitro e in vivo è il livello di complessità di molte proteine all'interno delle cellule. Proteine di membrana altamente idrofobiche, proteine che si assemblano in complessi enzimatici o in microfilamenti e proteine che sono modificate durante o dopo il processo di traduzione mediante legami con lipidi o carboidrati difficilmente seguiranno le vie di folding valide per piccole proteine globulari. Un'ulteriore considerazione è che, nella cellula, le proteine sono sintetizzate per gradi sui ribosomi e, nel caso di proteine dirette all'interno degli organelli, sono traslocate attraverso le membrane in forma estesa; esse dovrebbero quindi, secondo la teoria del folding cooperativo, permanere in forma denaturata almeno fino al compimento della sintesi del primo dominio strutturale.
Inoltre si è visto che alcune tappe lente nel folding delle proteine sono catalizzate da enzimi specifici.
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Enzimi e Chaperon Molecolari
Due passaggi cruciali per la cinetica del processo di folding in vitro, consistenti nell'isomerizzazione di legami covalenti, possono essere catalizzati da enzimi cellulari purificati.
Proteindisolfuroisomerasi (PDI)
L'enzima proteindisolfuroisomerasi (PDI) catalizza lo scambio tiolo-disolfuro e promuove la formazione, l'isomerizzazione o la riduzione di ponti disolfuro all'interno delle proteine. Poiché solo le proteine della via secretiva contengono legami disolfuro, PDI è localizzato essenzialmente in compartimenti cellulari che sono parte integrante di tale via. Grazie alla presenza di questo enzima, in vivo la formazione di legami disolfuro corretti può essere molto rapida.
Peptidil Prolil cis-trans Isomerasi (PPIasi)
Gli enzimi peptidil prolil cis-trans isomerasi (PPIasi) catalizzano l'altrimenti lenta isomerizzazione dei legami peptidici che precedono i residui amminoacidici di prolina. L'isomerizzazione dei legami peptidici amminoacido-prolina non corretti è, perciò, uno di quei passaggi lenti cruciali nel determinare la cinetica di folding di una proteina nella cellula. La reazione può essere catalizzata da enzimi con attività tipo PPIasica. Le PPIasi sono molto abbondanti, distribuite in modo quasi ubiquitario e sono presenti in tutti i compartimenti cellulari.
Chaperon Molecolari
Alcune famiglie di proteine, strutturalmente non correlate ma universalmente conservate, aiutano le proteine neosintetizzate ad assumere la loro conformazione nativa. Queste proteine, ora collettivamente denominate 'chaperon' molecolari, si legano ai polipeptidi quando si trovano nello stato totalmente o parzialmente denaturato, impedendone così l'aggregazione. Le chaperon molecolari sono piuttosto abbondanti e l'espressione di molte di esse aumenta notevolmente in diverse condizioni di stress della cellula. Per ragioni storiche molte di queste chaperon molecolari sono classificate come 'proteine dello shock da calore' (Hsp, Heat shock proteins) o proteine da stress.
La maggioranza delle chaperon identificate finora appartiene a famiglie proteiche molto conservate. Nonostante siano state identificate numerose classi di chaperon, ci occuperemo solo delle famiglie di chaperon Hsp60 (GroEL) e Hsp70 (DnaK), che sono quelle maggiormente studiate.
Caratteristica comune delle chaperon è la capacità di riconoscere polipeptidi solo allo stato non nativo.
Hsp70
Membri della famiglia delle Hsp70 si trovano in tutte le cellule procariotiche ed eucariotiche, nel citoplasma, nel nucleo, nel reticolo endoplasmatico, nei mitocondri e nei cloroplasti. Alcune proteine di questa grande famiglia sono essenziali per la crescita cellulare, altre sono copiosamente espresse in seguito a shock da calore, altre ancora, chiamate Hsc (Heat shock cognate) sono espresse, invece, in modo costitutivo.
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