Le informazioni contenute nel DNA vengono utilizzate dalla cellula per sopravvivere ed esercitare le proprie funzioni attraverso la sintesi delle proteine, macromolecole che svolgono molti ruoli biologici (strutturale, catalitico, regolatorio…). Il passaggio dal gene, l’unità funzionale del DNA, alla proteina avviene in due fasi: la trascrizione del DNA genera l’RNA, la traduzione dell’RNA porta alla sintesi della proteina.
Il Ruolo del DNA e dell'RNA nella Sintesi Proteica
Possiamo immaginare il DNA come il manuale di istruzioni della cellula. Questo manuale è diviso in capitoli, i geni. È stato stimato che il genoma umano (l’insieme dei geni presenti nel DNA delle cellule umane) contenga circa 20.000 sequenze che forniscono alla cellula le istruzioni per sintetizzare proteine (in gergo si dice che “codificano una proteina”). La porzione di DNA non codificante è enorme e il suo ruolo non è ancora ben compreso.
Non tutte le proteine vengono sintetizzate in ogni cellula e/o in ogni momento. Il primo passaggio nella sintesi di una proteina consiste nella trascrizione del DNA, che possiamo considerare come un “ordine di produzione”. In questo processo, la sequenza del gene viene copiata mediante la sintesi di una molecola di acido ribonucleico (RNA).
Trascrizione del DNA in RNA
Come il DNA, l’RNA è costituito da nucleoidi contenenti un gruppo fosfato, uno zucchero (il ribosio) e una base azotata (adenina, citosina, guanina e uracile [U], questo ultimo in sostituzione della timina presente nel DNA). Similmente a quanto avviene nella duplicazione, un filamento di DNA funge da stampo per la sintesi del nuovo acido nucleico: il filamento di RNA è quindi complementare al filamento di DNA. L’enzima chiave della trascrizione è l’RNA polimerasi. Questo enzima, assieme a proteine accessorie, si lega al DNA in corrispondenza di una zona a monte del gene che deve essere trascritto, chiamata promotore. Sequenze chiamate enhancer controllano l’attivazione della trascrizione.
Man mano che la doppia elica di DNA si svolge, l’RNA polimerasi aggiunge nucleotidi al filamento di RNA; la sintesi avviene in direzione 5’-3’. Nelle cellule umane esistono tre tipi di RNA polimerasi: l’RNA polimerasi II sintetizza l’RNA messaggero (mRNA) che codifica la sequenza della proteina, mentre l’RNA polimerasi I e III sintetizzano l’RNA ribosomiale (rRNA) e l’RNA transfer (tRNA) coinvolti nel processo di traduzione. Una sequenza di stop segnala alla polimerasi quando interrompere la sintesi dell’RNA. L’RNA messaggero subisce poi un processo di maturazione, in cui vengono eliminate alcune sequenze intercalanti (introni) e mantenute solo le sequenze codificanti (esoni); l’RNA maturo è perciò più corto di quello appena sintetizzato (pre-mRNA). Grazie al processo di splicing, da un singolo trascritto possono essere generati più mRNA maturi che codificano forme alternative di una stessa proteina.
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Traduzione dell'RNA in Proteina
Quando la cellula è in possesso dell’ordine di produzione (mRNA), può inviarlo alle fabbriche delle proteine, i ribosomi. È in questi organelli, costituiti da proteine e rRNA e localizzati nel citoplasma, che avviene l’assemblaggio della proteina. Il processo di traduzione dell’RNA si basa sull’esistenza di un codice genetico che mette in relazione la sequenza del DNA con la sequenza degli amminoacidi, le unità base delle proteine. Esistono 20 tipi di amminoacidi (leucina, glicina, metionina…). Una sequenza di tre nucleotidi è detta codone e codifica l’informazione per un singolo amminoacido. Il codice è ridondante: più codoni possono codificare per lo stesso amminoacido.
Un esempio per chiarire: sia il codone AAA che il codone AAG codificano per la lisina, ma sia il codone AAA sia il codone AAG codificano solo per la lisina. Esistono 3 codoni di stop, che segnalano la fine della sequenza codificante. Gli amminoacidi arrivano nel ribosoma trasportati dai tRNA. Una porzione del tRNA (anticodone) si appaia al codone corrispondente e permette che sia il corretto amminoacido a legarsi alla catena di amminoacidi nascente. Mutazioni nella sequenza nucleotidica portano a mutazioni nella sequenza amminoacidica della proteina.
Il Ruolo degli Amminoacidi nella Sintesi Proteica
La sintesi proteica è il processo mediante il quale la cellula produce le proteine di cui necessita. Gli amminoacidi sono le molecole semplici che unendosi tra di loro danno luogo alle proteine. Il codice genetico racchiude l'informazione per la sequenza dei vari amminoacidi nella proteina che deve essere sintetizzata. La sequenza proteica è fondamentale per l'ottenimento non solo di una proteina funzionante ma per ottenere proprio quella particolare proteina di cui la cellula necessita in un dato momento della sua vita.
Gli amminoacidi (o aminoacidi) sono molecole quaternarie costituite da carbonio, idrogeno, ossigeno ed azoto. Gli aa sono i costituenti delle proteine, ne esistono 20 tutti diversi tra di loro. Tutti gli amminoacidi hanno una struttura comune rappresentata da un atomo di carbonio centrale (chirale in 19 dei 20 aa) legato a sinistra al gruppo amminico (per convezione sempre a sinistra in maniera da rappresentare gli enantiomeri levogiri presenti negli organismi viventi) e il gruppo carbossilico a destra, completano i 4 legami del carbonio un atomo di idrogeno ed un residuo o radicale (R) che è diverso per ogni molecola e giustifica l'esistenza di 20 aa diversi tra loro.
Tutti gli amminoacidi sono molecole definite switterioni poiché possono comportarsi sia da base che da acido a seconda del pH nel quale si trovano, al pH citosolico sono neutri nella loro struttura comune dato che il gruppo carbossilico è dissociato (portando dunque una carica netta negativa) ed il gruppo amminico è protonato (portando dunque una carica netta positiva). La carica netta della struttura comune amminoacidica è quindi zero, vi sono aa carichi positivamente se possiedono un secondo gruppo amminico e dunque contengono 2 cariche positive ed una sola negativa e vi sono aa negativi se possiedo un secondo gruppo carbossilico dissociato e quindi hanno due cariche nette negative ed una sola positiva.
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I Protagonisti della Sintesi Proteica
I protagonisti della sintesi proteica sono l'RNA definito messaggero (mRNA), poiché porta l'informazione dal nucleo al citosol, e i ribosomi. Questi ultimi sono corpuscoli costituiti da proteine e molecole particolari di RNA dette ribosomiali (piccoli RNA trascritti nel nucleolo nucleare da geni specifici, indicati con rRNA). Ogni ribosoma è costituito da due subunità: la maggiore identificata dal suo coefficiente di sedimentazione (S) come 60S e la minore di 40S. Il ribosoma completo risulta di 80S. La subunità grande è costituita da circa 49 proteine e dagli rRNA: 5S, 28S e 5,8S. Nei procarioti i ribosomi sono più piccoli (il ribosoma completo ha coefficiente 70S): la subunità grande 50S è costituita da 34 proteine e da 2 rRNA: 5S e 23S.
Fasi della Sintesi Proteica
La sintesi proteica è quel processo le cui fasi analizzeremo di seguito, nel quale il messaggio dell'mRNA viene "tradotto" in linguaggio proteico per la produzione di una specifica proteina costituita da una ben definita sequenza di amminoacidi. Gli amminoacidi sono portati al ribosoma che sta scorrendo sull'mRNA da speciali molecole di RNA, dette transfer e indicate con la sigla tRNA. Esistono 61 tRNA per i 20 amminoacidi sulla base della degenerazione del codice genetico. La specificità del tRNA è determinata per il suo amminoacido dalla sequenza dell'anticodone e il legame tra il tRNA e l'amminoacido è catalizzato da uno specifico enzima detto amminoacil-tRNA sintetasi.
La prima fase è quella definita "inizio della traduzione" nella quale viene identificato il primo codone del messaggero che è sempre AUG ed identifica la metionina. Il primo codone AUG si trova davanti al sito P del ribosoma ed un secondo tRNA portante il secondo amminoacido della proteina viene a posizionarsi nel sito A, si forma il legame peptidico tra l'amminoacido 1, la metionina ed il secondo amminoacido, il ribosoma scorre lungo il messaggero, il primo tRNA ormai vuoto esce dal ribosoma ed ora il secondo tRNA si trova nel sito P con agganciati i 2 amminoacidi. I codoni di stop non codificano per nessun amminoacido dunque non esistono per essi nella cellula tRNA con i relativi anticodoni dunque il sito A del ribosoma resta vuoto, questo è il segnale perché si leghino ad esso speciali proteine definite fattori di terminazione o di rilascio che danno il via ad una serie di eventi specifici per la fine della sintesi proteica.
Considerazioni aggiuntive
La sintesi proteica (o biosintesi delle proteine o traduzione) è il processo responsabile, nelle cellule viventi, della produzione di proteine sulla base dell'informazione genetica contenuta nella sequenza nucleotidica dell'mRNA (RNA messaggero) e quindi del DNA da cui l'mRNA è stato precedentemente codificato. La traduzione, uno dei processi più conservati in tutti gli organismi viventi, è il processo cellulare più complesso per numero di componenti e di interazioni molecolari implicate e impegna una gran parte delle risorse energetiche della cellula. Infatti, l'apparato di sintesi proteica include, oltre all'mRNA e ai ribosomi (costituiti da 50-80 diverse proteine e vari RNA ribosomali), anche più di trenta tipi di tRNA (RNA transfer o di trasferimento), una ventina di enzimi implicati nell'attivazione degli amminoacidi, numerosi fattori proteici necessari per le fasi di inizio, allungamento e terminazione della traduzione.
In una cellula procariotica ci sono circa 20.000 ribosomi e 200.000 molecole di tRNA per tradurre 1000-2000 molecole di mRNA; in complesso, tra il 30 e il 50% del peso secco di una cellula procariotica è dedicato alla sintesi proteica. La sintesi proteica consiste nella costruzione di proteine da parte del ribosoma che, con l'ausilio di altri componenti dell'apparato di traduzione, scorre sull'mRNA decifrandone l'informazione codificata e catalizza l'aggiunta progressiva di amminoacidi, uno alla volta, alla catena proteica nascente. L'mRNA viene 'letto' dai ribosomi sempre nella direzione 5′→3′, mentre la proteina viene sintetizzata sempre nella direzione ammino→carbossiterminale. La velocità di allungamento della catena amminoacidica è di circa venti amminoacidi al secondo nei procarioti ed è quasi dieci volte inferiore negli eucarioti. L'efficienza della produzione di proteine è inoltre aumentata dal fatto che più ribosomi possono legarsi in successione allo stesso mRNA e procedere in fila lungo lo stesso formando così un 'polisoma'.
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Lo studio del meccanismo molecolare della sintesi proteica ha recentemente fatto un salto di qualità grazie alla straordinaria impresa scientifica e tecnologica che ha portato alla risoluzione a livello atomico della struttura del ribosoma (fig.1). Ciò ha permesso infatti il passaggio da una descrizione alquanto schematica e superficiale delle strutture e interazioni molecolari coinvolte nella traduzione al loro studio e alla loro comprensione a livello molecolare molto più fini, compiti che terranno ancora impegnati molti gruppi di ricerca nei prossimi anni. In questa sede si tratteranno prima i principali componenti dell'apparato di traduzione (ribosomi, tRNA, mRNA) per passare poi alla descrizione del meccanismo distinguendo per convenienza le tre fasi, di inizio, di allungamento e di terminazione, sempre confrontando i processi nei procarioti e negli eucarioti.
Già dagli anni 1940-1950 era stata osservata una stretta correlazione tra la quantità di RNA nelle diverse cellule e la loro capacità di sintesi proteica, il che suggeriva un ruolo diretto dell'RNA nella sintesi proteica. Negli anni successivi, l'introduzione dell'uso di radioisotopi (in particolare 14C) per studiare l'incorporazione di amminoacidi nelle proteine di nuova sintesi e l'uso di metodi di microscopia elettronica e di ultracentrifugazione hanno permesso di identificare piccole particelle dense contenenti RNA, in parte libere nel citoplasma e in parte attaccate al reticolo endoplasmatico, che venivano indicate con vari nomi quali 'granuli basofili', 'microsomi', 'nucleoproteine' e altri. Divenne presto chiaro che questo componente particolato rappresentava la sede della sintesi proteica.
I ribosomi sono delle 'macchinette' molecolari che sintetizzano le proteine decodificando l'informazione portata dall'mRNA. Nonostante alcune differenze di grandezza e composizione che si riscontrano tra ribosomi di varie specie, le loro struttura e funzione sono rimaste altamente conservate durante l'evoluzione. Tutti i ribosomi procariotici ed eucariotici sono particelle ribonucleoproteiche, cioè sono composti da RNA e proteine assemblati a costituire due subunità ribosomali distinte, una maggiore e una minore. I ribosomi e le loro subunità vengono generalmente denominati in base alla loro velocità di sedimentazione, misurata mediante ultracentrifugazione ed espressa in unità Svedberg. Così i ribosomi procariotici vengono chiamati 70S perché hanno una velocità di sedimentazione di 70 Svedberg, mentre quelli citoplasmatici eucariotici, che sono un po' più grandi e sedimentano più velocemente, vengono chiamati 80S. Come schematizzato nella fig. 2, i ribosomi procariotici 70S sono costituiti dalle due subunità chiamate 50S e 30S, e quelli eucariotici 80S dalle subunità 60S e 40S. Va notato che i valori in S delle subunità non sono additivi rispetto a quelli dei ribosomi interi, perché la velocità di sedimentazione dipende non solo dalle dimensioni ma anche dalla forma e non è quindi una misura della massa.
La fig. 2 mostra anche come ciascuna subunità sia costituita da una o più molecole di rRNA e da numerose r-proteine (proteine ribosomali). La subunità 30S dei ribosomi procariotici contiene l'rRNA 16S costituito da circa 1540 nt (nt = nucleotidi) e 21 r-proteine diverse (chiamate S1, S2, S3, ecc.), mentre la subunità 50S contiene l'rRNA 23S (2900 nt), il piccolo RNA ribosomale 5S (120 nt) e 34 r-proteine (chiamate L1, L2, L3, ecc.). Nel complesso la massa del ribosoma procariotico è di circa 2500 kDa ed è costituita per circa metà da RNA e metà da proteine. Come si può vedere nella fig. 2, il ribosoma eucariotico è simile a quello procariotico, ma ha rRNA più lunghi, un numero maggiore di proteine e di conseguenza anche una massa maggiore, pari a circa 4200 kDa. Va detto che le cellule eucariotiche contengono, oltre ai tipici ribosomi 80S citoplasmatici, anche ribosomi all'interno dei mitocondri e, nel caso delle piante, anche nei cloroplasti. Questi ribosomi sono per vari aspetti più simili ai 70S procariotici che non agli 80S eucariotici, a ricordarci l'origine di questi organelli come endosimbionti procariotici. Il numero di ribosomi per cellula è molto variabile a seconda del tipo di cellula e delle sue condizioni di crescita.
Capire a fondo il meccanismo della sintesi proteica comporta la conoscenza dettagliata della struttura dei ribosomi. Quattro decenni di lavoro di numerosi gruppi di ricerca che hanno utilizzato varie tecniche progressivamente più complesse e raffinate, hanno portato nel 2001 alla risoluzione a livello atomico della struttura del ribosoma 70S. La fig. 3 mostra la struttura delle subunità 30S e 50S del ribosoma del batterio Thermus thermophilus. È interessante notare che questi importanti studi strutturali sono stati fatti su ribosomi preparati da organismi estremofili, quali Th. Come si può osservare nella fig. 3A, gli rRNA 16S e 23S assumono strutture specifiche secondarie per appaiamento intramolecolare di basi complementari. Essi si ripiegano poi in precise strutture tridimensionali (fig. 3B). Nella struttura delle subunità ribosomali gli rRNA costituiscono una specie di impalcatura su cui si assemblano le r-proteine (fig. 3C); alcune di queste stabiliscono legami forti direttamente con l'rRNA, mentre altre vi si legano solo dopo che si sono legate le prime. Nel complesso le r-proteine tendono a trovarsi nella parte esterna del ribosoma e presentano spesso prolungamenti che si infilano nella struttura dell'rRNA.
Il ribosoma contiene siti di legame per gli altri componenti dell'apparato di traduzione, l'mRNA e il tRNA, e per la catena proteica nascente. La fig. 4 mostra una rappresentazione schematica del ribosoma con i suoi siti attivi, mentre una rappresentazione grafica un po' più realistica e la struttura effettiva del ribosoma, determinata mediante cristallografia, sono mostrate nella fig. 1. Come indicato nella fig. 4A, la subunità minore del ribosoma contiene un canale in cui scorre l'mRNA, mentre il sito di uscita della catena peptidica nascente è costituito da un tunnel che attraversa la subunità maggiore. Ci sono tre siti di legame per tRNA: il sito A (amminoacilico o accettore) che lega il tRNA amminoacilato in ingresso, il sito P (peptidilico) che lega l'ultimo tRNA entrato e porta la catena peptidica nascente, e il sito E (exit) che lega il tRNA ormai scarico che deve essere rilasciato. I siti A e P si trovano all'interfaccia tra le due subunità, cosicché ciascuno di essi è composto di due emisiti, uno nella subunità minore e uno nella subunità maggiore del ribosoma. La fig. 4B mostra che i tRNA sono posizionati in modo che gli anticodoni, che si trovano all'estremo del braccio lungo della struttura a L dei tRNA, si possano appaiare con i codoni dell'mRNA nella subunità minore del ribosoma, in quello che viene chiamato 'centro di decodificazione'.
Verso la fine degli anni Cinquanta del Novecento Francis Crick ipotizzò l'esistenza di 'adattatori' molecolari in grado di riconoscere da una parte i codoni (triplette di nucleotidi) del messaggio genetico e dall'altra parte gli specifici amminoacidi da inserire nella sequenza delle proteine. Negli stessi anni era stata scoperta una classe di piccole molecole di RNA, che si rivelarono presto essere gli adattatori ipotizzati e che sono ora chiamati tRNA (RNA transfer o di trasferimento). In ogni cellula esiste almeno un tipo di tRNA per ciascuno dei venti tipi di amminoacidi utilizzati nella sintesi proteica, ma spesso ve ne è più di uno. Tutti i tRNA sono piccole molecole costituite da una sequenza di 75÷90 nt. Alcune regioni della sequenza sono conservate nei diversi tRNA, altre sono specifiche per ciascuno di essi. La fig. 5 mostra, come esempio, la struttura del tRNA per la fenilalanina di Saccharomyces cerevisiae e, in particolare nella fig. 5A, è riportata la sequenza nucleotidica di questo tRNA che, come tutti i tRNA, presenta una caratteristica struttura secondaria a trifoglio risultante dall'appaiamento di basi complementari tra diverse regioni della molecola, come mostrato nella fig. 5B. Riconosciamo nella struttura uno stelo, formato dalle due estremità della molecola, su cui si legherà l'amminoacido specifico, e tre anse. Di queste, quella centrale, opposta allo stelo, contiene l'anticodone, cioè la sequenza di tre nucleotidi che riconosce, per appaiamento di basi, il codone del messaggio genetico. La struttura secondaria a trifoglio di tutti i tRNA è ripiegata su sé stessa, come mostrato nella fig.
In effetti i tRNA non possono da soli svolgere il ruolo di adattatori molecolari ipotizzato da Crick. Infatti, mentre essi sono in grado di riconoscere direttamente (seppure con l'aiuto del ribosoma) il codone mediante interazioni specifiche codone-anticodone, non hanno però alcuna diretta affinità specifica per gli amminoacidi che devono caricare. Come i tRNA, le amminoacil-tRNA-sintetasi sono come minimo venti, essendone necessaria almeno una per ciascun tipo di amminoacido. Ogni amminoacil-tRNA-sintetasi è capace di riconoscere specificamente sia l'amminoacido sia il corrispondente tRNA e catalizza poi la formazione di un legame esterico ad alta energia tra il gruppo carbossilico dell'amminoacido e il gruppo ossidrilico 2′ o 3′ dell'adenosina, che costituisce l'estremità 3′ del tRNA. Questa energia di legame è molto importante perché verrà utilizzata successivamente per la formazione del legame peptidico nel corso della sintesi proteica; essa è derivata dall'idrolisi di una molecola di ATP al momento dell'attivazione dell'amminoacido da parte dell'amminoacil-tRNA-sintetasi stessa. Questa doppia reazione è molto complessa anche perché è essenziale, per l'accuratezza della sintesi delle proteine, che ogni tRNA sia caricato correttamente con l'amminoacido corrispondente.
Nel loro fondamentale lavoro del 1961 sulla regolazione dell'operone lattosio, François Jacob e Jacques Monod esclusero, sulla base di dati sperimentali, che l'rRNA (l'RNA strutturale dei ribosomi) con la sua grande stabilità metabolica potesse svolgere il ruolo di portatore dell'informazione per la sintesi delle proteine e ipotizzarono, quindi, l'esistenza di una distinta classe di molecole di RNA metabolicamente instabili, che chiamarono 'RNA messaggero', la cui vita media molto breve permettesse alla cellula di rispondere rapidamente ai cambiamenti ambientali adattando la produzione di proteine alle esigenze del momento. Così, delle tre classi di RNA coinvolte nella sintesi proteica, l'mRNA è quello che è stato scoperto per ultimo, anche perché più difficile da isolare e analizzare rispetto agli altri due componenti, rRNA e tRNA. Infatti, l'mRNA rappresenta quantitativamente una bassa percentuale degli RNA cellulari (2÷5% rispetto all'80% di RNA ribosomale e al 15% di tRNA).
Tutti gli mRNA di tutte le cellule procariotiche ed eucariotiche hanno almeno una regione codificante, cioè una serie di triplette di nucleotidi (codoni) che determinano l'ordine degli amminoacidi nella proteina sintetizzata seguendo le regole di corrispondenza codone/amminoacido del codice genetico. Inoltre, negli mRNA sono presenti anche regioni non codificanti (UTR, Untranslated region) che si trovano all'inizio (estremità 5′) e alla fine (estremità 3′) della molecola, e in alcuni casi anche all'interno della sequenza. Come mostrato nella fig. 6A, gli mRNA procariotici possono essere policistronici, cioè possono essere il prodotto della trascrizione di più geni adiacenti nel genoma (operoni) e codificare quindi per più proteine. In tal caso questi mRNA contengono, oltre a una 5′UTR all'estremità 5′ e una 3′UTR all'estremità 3′, anche una o più regioni non codificanti intergeniche (usualmente piuttosto corte, al massimo di qualche decina di nucleotidi), che separano le regioni che codificano per le varie proteine. Gli mRNA eucariotici sono invece quasi sempre monocistronici, cioè ogni mRNA codifica per una sola proteina essendo costituito da una 5′UTR seguita dalla regione codificante e poi da una 3′UTR (fig.
Un'altra caratteristica degli mRNA eucariotici è costituita dalla presenza di modificazioni delle due estremità 5′ e 3′, modificazioni che avvengono nel nucleo e che rientrano nei processi di maturazione degli mRNA, prima che questi vengano trasportati nel citoplasma. In particolare, come mostrato nella fig. 6B, l'estremità 5′ è protetta da una struttura chiamata 5′Cap (cappuccio), formata da una base insolita (m7G, cioé Guanina metilata in posizione 7) unita, con un particolare legame fosfodiesterico 5′-5′ trifosfato, al primo nucleotide dell'mRNA. L'estremità 3′ degli mRNA eucariotici è estesa da una coda di poli(A), cioè una sequenza di circa duecento adenine che vengono aggiunte da uno specifico complesso enzimatico al momento della terminazione della trascrizione. Ambedue queste modificazioni, 5′Cap e poli(A) al 3′, non soltanto proteggono le estremità degli mRNA da attacchi esonucleolitici, ma possono anche svolgere un ruolo.
Oppure, una mutazione nella sequenza di mRNA può cambiare l'amminoacido specifico, codificato in quella posizione della catena polipeptidica. Questo cambiamento può influire sulla capacità della proteina di funzionare o di ripiegarsi correttamente. Lo spostamento delle molecole, soprattutto di grandi dimensioni, tra i vari compartimenti cellulari, tra le cellule e tra i tessuti, è un processo molto delicato. Viene regolato, a seconda della destinazione, soprattutto dalle informazioni stesse della proteina stessa.
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