La proteomica è una disciplina scientifica che ha come obbiettivo l'identificazione delle proteine per associarle con uno stato fisiologico e monitorarne l'alterazione in stati differenti o in seguito a trattamenti. La proteomica permette di correlare fra il livello di proteine prodotte da una cellula o tessuto e l'inizio o la progressione di uno stato di stress.
L'abbondanza di informazioni fornite da una ricerca proteomica sono complementari con le informazioni genetiche generate da ricerche genomiche. La proteomica, infatti, sarà cruciale per lo sviluppo della genomica funzionale.
Metodi di Identificazione delle Proteine
Tra i metodi di identificazione delle proteine troviamo quello dell’identificazione e del sequenziamento delle proteine. L'approccio proteomico classico utilizza metodi elettroforetici in due dimensioni che permettono di separare le proteine prima per punto isoelettrico e poi in base al peso molecolare consentendo un'alta risoluzione e riproducibilità delle mappe proteomiche.
Esistono tecniche di preparazione del campione che permettono di isolare specifiche cellule, producendo un campione relativamente puro per tipo cellulare per le successive analisi. Il profilo delle proteine su un gel bidimensionale viene analizzato con tecniche di analisi d'immagine.
Le mappe proteomiche sono comparate per individuare le proteine che sono sopra o sotto espresse in differenti stati fisiologici o in seguito a trattamenti. I dati ottenuti dall'analisi del proteoma, in particolare i dati di spettrometria di massa, sono confrontati in banche dati, che in alcuni casi sono pubbliche.
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Test del Biureto
L’esperienza propone lo svolgimento di una reazione chimica finalizzata al riconoscimento delle proteine. Il campione contenente le proteine viene fatto reagire con il Biureto, un reattivo contenente rame (II) e tartrato di sodio e potassio. Le proteine in ambiente basico e in presenza di ioni $Cu^{2+}$ formano un complesso colorato violetto.
Il test del Biureto è positivo per proteine e polipeptidi, mentre è negativo per dipeptidi ed amminoacidi liberi.
Preparazione del Reattivo di Biureto
- Si preparano 300 ml di $NaOH$ al 10% m/V.
- Si pesano separatamente 1,5 g di $CuSO_4$ e 6 g di Sodio e Potassio Tartrato.
- I due sali vengono disciolti nella soluzione di $NaOH$ al 10% (m/V).
- Si porta a volume di 1L con acqua.
- Conservare la soluzione al riparo della luce (contenitore scuro o avvolto in alluminio).
Il reattivo è così preparato in quanto il rame in soluzione, $Cu^{2+}$ in ambiente basico, dovrebbe precipitare come idrossido, $Cu(OH)_2$. La presenza del tartrato mantiene il rame in soluzione attraverso la formazione di un complesso in cui lo ione rameico centrale viene tetracoordinato dagli atomi di ossigeno delle funzioni carbossiliche.
Il complesso impartisce alla soluzione una intensa colorazione blu.
Preparazione del Riferimento Positivo con Albume d'Uovo
- Rompere l’uovo ed estrarne solo l’albume.
- Prelevare mediante una siringa circa 1 ml di albume e versarlo in un bicchierino di plastica.
- Aggiungere 5 ml di acqua all'albume.
- Versare la soluzione albume-acqua in un provettone (contenitore di vetro).
- Inserire nella provetta, mediante l’uso di una siringa, 2 ml di reattivo di Biureto.
- Miscelare energicamente.
- Osservare la formazione di un cambiamento di colore della soluzione dal blu al viola, dovuta al fatto che il rame viene complessato dai gruppi funzionali della proteina.
La colorazione blu-viola in presenza di proteine è dovuta al fatto che gli ioni rameici del reattivo formano un complesso di coordinazione con gruppi NH (da due a quattro) appartenenti ad altrettanti legami peptidici. Per questo, il saggio sarebbe negativo con amminoacidi liberi e dipeptidi, mentre è positivo per tripeptidi, polipeptidi e molecole proteiche, in cui si ha un sufficiente numero di gruppi $-CONH^-$ (ma anche $CH_2NH_2$ e $CSNH$).
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Preparazione del Riferimento Negativo con Acqua Distillata
Il riferimento negativo si può ovviamente considerare quello che si ottiene su acqua distillata, aggiungendovi due ml di reattivo: la colorazione intensa del reattivo mantiene la sua caratteristica tonalità azzurra.
Indagine: Quali Alimenti Contengono Proteine?
L'insegnante propone agli studenti un'attività di indagine basata sulla metodica sperimentale precedentemente messa a punto per testare la presenza o l'assenza di componente proteica in vari tipi di alimenti.
Preparazione dei Campioni (Sostanze Liquide)
- Prelevare mediante una siringa circa 1 ml di del campione e versarlo in un bicchierino di plastica.
- Aggiungere 5 ml di acqua al campione.
- Versare il campione in un provettone (contenitore di vetro).
Analisi delle Proteine in Polvere
L’analisi delle proteine è essenziale per determinare la qualità del prodotto e le sue prestazioni e interpretazione adeguate sono fondamentali per il rilevamento delle frodi.
Importanza delle Proteine in Polvere
Assicurare un buon contributo di proteine nella dieta è fondamentale da un punto di vista della salute. Nel campo sportivo, le proteine svolgono un ruolo molto importante negli adattamenti muscolari all’esercizio. Idealmente, le proteine dovrebbero provenire dal cibo, ma la proteina in polvere è un prodotto di altissima qualità nutritiva e che facilita il consumo di questo nutriente.
Importanza dell’Analisi delle Proteine
La competitività esistente tra i produttori significa che vengono offerte sempre più offerte e i prezzi vengono adeguati al massimo. Non sorprende che i casi di frode sui prodotti abbiano messo a dura prova il settore, costringendolo a pagare solo per i peccatori in molte occasioni. Per questo motivo, è già un obbligo fornire informazioni chiare, basate su test di laboratorio e specificando la metodologia utilizzata.
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La “adulterazione economica” è definita come la sostituzione fraudolenta di un componente autentico o naturalmente presente nel cibo con un componente non autentico più economico, con l’unico scopo di guadagnare più denaro.
Perché realizzare l’Analisi delle Proteine?
- Stabilire il valore di mercato dei prodotti proteici.
- Valutare la qualità degli ingredienti a base di proteine.
- Notificare la conformità degli ingredienti sia per il consumatore che per il venditore, nonché per gli aspetti normativi.
- Determinare l’autenticità degli alimenti e degli ingredienti proteici.
- Analizzare il contenuto nutrizionale degli alimenti per l’etichettatura.
Strategie per rilevare le frodi alimentari
Esistono due approcci principali per identificare potenziali frodi nell’industria alimentare:
- Analisi delle sostanze adulteranti: In questo caso, il risultato positivo sarebbe l’assenza di un materiale specifico. Il problema con questo approccio è che queste sostanze devono essere conosciute in anticipo.
- Analisi della purezza degli ingredienti: Questa strategia è efficace quando l’adulterante viene aggiunto in quantità sufficientemente elevate da rilevare una mancanza di purezza del materiale originale.
Fondamenti delle Analisi delle Proteine
Sebbene esistano numerose tecniche per analizzare il contenuto proteico dei prodotti alimentari, in questo articolo ci concentreremo sulla spiegazione delle analisi che possono essere più frequenti nel contesto degli integratori sportivi.
| Tipo di Informazione | Descrizione |
|---|---|
| Fonte o fonti | Indicate nella lista degli ingredienti. |
| Quantità di proteine | È indicata nella tabella nutrizionale. |
| Profilo amminoacidico | Aminogramma. |
Metodi di rilevamento dell’azoto totale
I metodi più comuni si basano sulla determinazione del contenuto di azoto totale e sull’estrapolazione di questi dati alla quantità di proteine totali, attraverso l’uso di determinati fattori di conversione. Cioè, sono metodi indiretti.
Kjeldahl
Si basa su 4 passaggi in base ai quali il campione viene digerito in modo da poter misurare l’azoto che fornisce (sia da fonti proteiche che non proteiche). Per fare ciò, questo azoto viene convertito in ammoniaca, che viene isolata attraverso un processo di distillazione. Successivamente, il contenuto di azoto totale viene determinato indirettamente, attraverso una serie di reazioni chimiche. La sua principale debolezza risiede nella mancanza di differenziazione tra contenuto proteico e non proteico.
Dumas o metodo di combustione
La sua base si basa sulla formazione di sostanze gassose a seguito della combustione del campione. Questo produce, tra gli altri, NOx e N2. Dopo aver ridotto gli NOx a N2, viene determinato l’N2 totale.
Fattori di conversione
Il fattore 6.25 è stato tradizionalmente utilizzato per calcolare la quantità di proteine dai valori di azoto. Si basa sul presupposto che il contenuto di azoto delle proteine sia del 16%.
L’importanza dell’aminogramma
L’aminogramma non è altro che la scomposizione e la quantificazione degli amminoacidi che compongono una proteina. La sua determinazione ci consente due tipi di analisi delle proteine:
- Qualitativa: a causa della differenziazione di ciascuno degli amminoacidi.
- Quantitativa: aggiungendo le quantità di ogni amminoacido possiamo ottenere la quantità totale di proteine.
Come possiamo analizzare l’aminogramma di una proteina?
Una delle tecniche più appropriate a questo scopo è l’HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Con l’HPLC ottieni qualcosa di simile a questo grafico: Prima dell’analisi, il campione viene preventivamente trattato, in modo che sia consentita la rilevazione individuale di ciascun amminoacido Il fondamento della tecnica, a un livello molto elementare, si basa sul fatto che ogni amminoacido ha proprietà differenti a livello fisico-chimico e, variando le condizioni dell’analisi, è consentita la rilevazione sequenziale di questi amminoacidi. Ogni picco corrisponde a un amminoacido e l’area sotto la curva di ciascun picco consente di determinare la concentrazione di quell’amminoacido.
Tecniche di Analisi dell’Espressione Genica e Proteica
Per valutare se un gene è espresso in cellule di interesse occorre stabilire se in tali cellule è presente il corrispondente mRNA; ciò può essere fatto con tecniche come il Northern blot o la real-time PCR. Per valutare se una proteina è prodotta in cellule di interesse occorre verificarne la presenza con tecniche come il Western blot, l’ELISA o la citometria a flusso.
Analisi dell’espressione genica
Una delle prime tecniche messe a punto per l’analisi dell’espressione genica in una cellula è il Northern blot. Al momento, invece, la tecnica più utilizzata per valutare l’espressione genica è la real-time PCR (RT-PCR). Se si vogliono valutare con un singolo esperimento tutti gli mRNA espressi dalle cellule, ossia il loro trascrittoma, si utilizzano tecniche come i microarray e l’RNA-seq.
Analisi dell’espressione delle proteine
Per quanto riguarda l’analisi dell’espressione delle proteine delle cellule di interesse, la tecnica di laboratorio maggiormente usata è il Western blot. È possibile valutare se le cellule esprimono una proteina solubile (ossia che viene rilasciata all’esterno della cellula) raccogliendo un campione del liquido in cui sono state fatte crescere le cellule e analizzandolo con il test ELISA. Per valutare l’espressione di proteine presenti sulla membrana esterna delle cellule o di proteine solubili è anche possibile usare la citometria a flusso.
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