Le Proteine: Struttura, Proprietà e Metodi di Studio

Le proteine (dal greco πρώτειος principale, primario) si trovano in tutte le forme note di vita e sono macromolecole il cui peso molecolare può variare tra 5.000 circa e diversi milioni. Una molecola proteica è formata da una o più catene polipeptidiche, composte di α-amminoacidi legati insieme da legami peptidici.

Introduzione

Al principio del Novecento non si conosceva praticamente nulla circa la chimica delle proteine: la nostra conoscenza della struttura di queste molecole è una delle principali acquisizioni degli scienziati del XX secolo. La necessità di isolare queste sostanze così labili da una miscela di molecole simili e la mancanza di una tecnologia adeguata per studiare le proteine una volta isolate sono state le maggiori difficoltà da superare. Le soluzioni a molti di questi problemi sono state ottenute applicando e modificando tecniche proprie della chimica fisica, analitica e organica. Oltre a mancare di una tecnologia adeguata, il biochimico all'inizio del XX secolo era sotto l'influenza del dogma secondo il quale le proteine non erano entità discrete, ma piuttosto strutture labilmente organizzate, di composizione variabile.La dimostrazione che le proteine sono molecole chimicamente e fisicamente omogenee ha costituito il fondamento concettuale per lo studio della struttura proteica. Le dimostrazioni di omogeneità erano basate:

1. sulla cristallizzabilità;
2. sulla non variabilità nella composizione e nella sequenza degli amminoacidi.

Un discorso sulla struttura delle proteine può essere affrontato ponendo le seguenti domande:

1. quali sono gli amminoacidi costitutivi delle proteine?
2. qual è la sequenza di questi amminoacidi e quale informazione vi è contenuta?

Amminoacidi

Dei numerosissimi composti che possono avere questa formula, solo 20 si trovano comunemente nelle proteine; le formule di questi amminoacidi e della prolina, che a rigor di termini è un imminoacido, sono riportate nella tab. I. Nelle proteine sono stati trovati sempre solo amminoacidi della configurazione L, dove L si riferisce alla configurazione assoluta e non all'attività ottica.Come si vede dalla tab. I, la natura della catena laterale R varia molto nei diversi amminoacidi; questi sono in genere classificati, a seconda della natura della catena laterale, in polari carichi, polari non carichi, e non polari o neutri: i primi hanno nella catena laterale un gruppo ionizzabile e si dividono in basici (lisina, istidina, arginina) e acidi (acido aspartico e acido glutammico); benché il gruppo fenolico della tirosina e il gruppo solfidrilico della cisteina possano ionizzarsi, questi due amminoacidi vengono classificati tra i polari non carichi a causa delle loro caratteristiche complessive. La presenza di questi gruppi ionizzabili rende le proteine polielettroliti la cui carica varia in funzione del pH: i valori normali di pKa di questi gruppi sono riportati nella tab. La terza categoria, amminoacidi non polari o neutri, comprende glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, metionina e fenilalanina.Quando questi amminoacidi sono sciolti in acqua, le molecole di solvente intorno alle catene laterali tendono a formare strutture ordinate. Le interazioni fra parecchie di tali catene laterali causano una disorganizzazione dell'acqua e, di conseguenza, un favorevole aumento di entropia del sistema; questo tipo di interazione, detta idrofobica, è ritenuto il principale responsabile della formazione e del mantenimento della struttura proteica. Devono pertanto essere forniti dall'alimentazione, tramite gli alimenti contenenti proteine di alto valore biologico (VB).

Legame Covalente

I due principali legami che si riscontrano nelle proteine sono il legame peptidico e il ponte disolfuro. Nel 1902 fu avanzata l'ipotesi che gli amminoacidi fossero uniti con legame peptidico. Quest'ipotesi era basata sulle seguenti osservazioni:

1. benché le proteine come tali contengano pochi gruppi amminici e carbossilici liberi, la loro idrolisi chimica o enzimatica libera quantità eguali di questi gruppi;
2. enzimi capaci di idrolizzare le proteine sono capaci di idrolizzare anche piccoli substrati peptidici sintetici;
3. l'idrolisi parziale delle proteine produce di- e tripeptidi identici a quelli ottenuti per sintesi.

La formazione di un legame peptidico prevede la condensazione di due AA con produzione di una molecola d'acqua e formazione di un legame amminico. Questo legame covalente (molto stabile) si forma tra il gruppo carbossilico (-COOH) di un AA ed il gruppo amminico (-NH2) dell'AA adiacente nella catena peptidica in crescita.Le distanze interatomiche e gli angoli di legame sono stati determinati con la cristallografia a raggi X in diversi amminoacidi e piccoli peptidi allo stato cristallino: tali valori sono indicati nella fig. La fig. 1 riporta la forma trans del legame peptidico; la forma cis è molto rara. Di particolare interesse è la lunghezza di 1,32 Å del legame C−N; questo valore è intermedio tra quello tipico del legame singolo carbonio-azoto (≈1,49 Å) e quello del doppio legame carbonio-azoto (1,27 Å); ciò indica che il legame peptidico ha notevoli caratteri di doppio legame e che si tratta in realtà di un ibrido di risonanza.Lo studio dell'idrolisi del composto modello N-benzoil-glicil-tirosinammide indica che l'energia libera di idrolisi del legame peptidico è circa −0,4 kcal/mole; poiché è facile idrolizzare le proteine ad amminoacidi, era prevedibile che questa energia libera fosse negativa. Da questa osservazione si traggono due conseguenze:

1. le proteine sono (relativamente) instabili in condizioni fisiologiche e possono essere degradate in presenza di enzimi idrolitici; da questo punto di vista si comportano come altri polimeri biologici (acidi nucleici, carboidrati), che hanno anch'essi un valore negativo di energia libera di idrolisi;
2. la sintesi delle proteine richiede energia.

Mentre il legame peptidico è il mezzo per unire i vari amminoacidi a formare la catena polipeptidica, il ponte disolfuro tra due semiresidui di cistina serve a stabilizzare la struttura proteica; ciò viene realizzato congiungendo o differenti regioni della stessa catena polipeptidica (legame intracatena) o due differenti catene polipeptidiche (legame intercatene). Per esempio l'insulina (v. fig. Il legame disolfuro può essere ridotto per trattamento con composti tiolici in eccesso (per es.

Caratterizzazione fisica e chimica delle proteine

Uno studio completo delle proprietà strutturali di una proteina comprende:

1. la sua caratterizzazione generale;
2. l'analisi della sequenza degli amminoacidi;
3. la determinazione della conformazione della proteina.

Questi studi richiedono spesso quantità relativamente grandi di proteina purificata. La proteina studiata è spesso presente in piccole quantità (〈1%) in una miscela complessa di altre proteine con caratteristiche fisiche simili. Complica il problema il fatto che la purificazione dev'essere effettuata in condizioni blande, poiché valori estremi di temperatura, di pH e composizione del solvente spesso causano l'irreversibile denaturazione della proteina con conseguente perdita dell'attività biologica. Tutte queste difficoltà hanno portato allo sviluppo di tecniche di purificazione molto selettive.I primi metodi di purificazione si basavano sulla differente solubilità delle proteine in varie soluzioni saline e in tamponi contenenti solventi organici; più recentemente sono stati messi a punto sistemi cromatografici che separano in base a una differenza di carica (scambio ionico), di dimensioni (gelfiltrazione), di specifici legami (cromatografia di affinità); una proteina può essere generalmente purificata usando una combinazione di alcuni di questi metodi. Il criterio usuale di purezza, per una proteina, è l'omogeneità, determinata con metodi che separano le proteine in base alla carica (per es. elettroforesi, focalizzazione isoelettrica), alla dimensione (velocità di sedimentazione, elettroforesi su gel in presenza di dodecilsolfato di sodio) e a caratteristiche immunologiche (metodo di O.Vi sono numerosi metodi per la determinazione del peso molecolare delle proteine. Nel 1923 fu costruita l'ultracentrifuga allo scopo di determinare il peso molecolare di macromolecole.Benché le proteine possano avere pesi molecolari di diversi milioni, le proteine più grandi sono in genere composte da subunità polipeptidiche più piccole; queste subunità hanno spesso un peso molecolare inferiore a 100.000 e sono tenute insieme da interazioni non covalenti o da ponti disolfuro (v. tab. Il peso molecolare delle subunità viene determinato molto accuratamente (±5%) con l'equilibrio di sedimentazione in solventi denaturanti contenenti sostanze riducenti; un metodo alquanto meno accurato ma rapido, particolarmente adatto nel caso di subunità diseguali, è rappresentato dall'elettroforesi su gel in presenza di dodecilsolfato di sodio. I rapporti tra logaritmo del peso molecolare della subunità e mobilità elettroforetica, per diverse proteine, sono riportati nella fig.Le quantità relative di ciascun amminoacido in una proteina possono essere determinate dopo idrolisi completa della stessa; si è trovato che l'idrolisi effettuata in HCl 6 N a 110° sotto vuoto per 24 ore produce una scissione pressoché completa della proteina con minima distruzione di amminoacidi, eccetto il triptofano, l'asparagina e la glutammina; la cisteina e la cistina si determinano meglio sotto forma di acido cisteico dopo ossidazione con acido performico (v. eq. 2). Oggi si adoperano largamente metodi automatici per l'analisi cromatografica degli amminoacidi: questi sono separati su di una resina polistirenica solfonata e determinati quantitativamente facendo reagire l'eluato con ninidrina, per formare un composto colorato: l'intensità del colore (assorbanza o estinzione) viene misurata e registrata automaticamente, e ne risulta un diagramma come quello riportato in fig.La determinazione qualitativa e quantitativa degli amminoacidi ammino- e carbossi-terminali di una proteina non solo fornisce un'ulteriore informazione strutturale, ma può anche essere usata per determinare il numero di catene polipeptidiche che formano la proteina e per accertarne l'omogeneità: per esempio, la presenza di 2 moli di alanina ammino-terminale per mole di proteina indica che la proteina è un dimero, mentre il trovare 0,8 moli di alanina e 0,2 di leucina per mole di proteina indica una preparazione eterogenea.L'amminoacido carbossi-terminale viene generalmente identificato tramite l'idrazinolisi o la digestione della proteina con carbossipeptidasi. L'idrazina trasforma tutti gli amminoacidi della catena polipeptidica, eccetto il residuo carbossi-terminale, nelle idrazidi corrispondenti, le quali possono essere separate cromatograficamente dall'amminoacido carbossi-terminale non modificato. Le carbossipeptidasi staccano sequenzialmente gli amminoacidi a partire dall'estremità carbossilica della catena polipeptidica: quando una proteina dalla sequenza H2N−Leu-Glu-PheCOOH viene trattata con carbossipeptidasi A e si - fanno prelievi nel tempo per seguire la comparsa di amminoacidi liberi, si ottiene un risultato come quello riportato in fig. 5.

Determinazione della sequenza degli amminoacidi

Nel 1955 fu pubblicata la prima sequenza degli amminoacidi di una proteina a molecola relativamente piccola, l'ormone insulina: questo risultato è stato veramente una pietra miliare nello studio della struttura delle proteine, tanto più notevole se si considerano le tecniche relativamente primitive disponibili a quel tempo. Questo studio non solo ha dimostrato che le proteine hanno struttura chimica definita, ma ha ulteriormente stimolato la ricerca in questo campo: da allora la tecnologia per l'analisi della sequenza degli amminoacidi è stata molto perfezionata e sono state così determinate le sequenze di centinaia di catene polipeptidiche.La purificazione della proteina comprende la separazione delle diverse subunità, l'apertura dei legami disolfuro e l'alchilazione dei residui di cisteina. Le subunità non identiche, tenute insieme esclusivamente da legami non covalenti (come per esempio nell'emoglobina), possono essere separate per precipitazione frazionata o mediante cromatografia a scambio ionico o gelfiltrazione in solventi che impediscono l'aggregazione. Queste tecniche possono essere applicate anche nel caso di subunità non identiche unite da ponti disolfuro previa ossidazione o riduzione e alchilazione dei residui cisteinici: l'apertura dei legami disolfuro tramite ossidazione con acido performico trasforma sia la cistina sia la cisteina in acido cisteico (mentre l'apertura mediante riduzione con 2-mercaptoetanolo trasforma la cistina in cisteina). Tutte le cisteine inizialmente presenti e quelle prodotte per riduzione della cistina sono poi alchilate per evitare la loro ossidazione spontanea; gli agenti alchilanti più usati sono lo iodoacetato e la etilen-immina, che trasformano la cisteina rispettivamente in S-carbossimetilcisteina e S-amminoetilcisteina.Nell'ulteriore passaggio la catena polipeptidica viene spezzata in punti specifici, dando luogo a peptidi di cui si determina la sequenza; per spezzare la catena proteica si usano metodi chimici ed enzimatici. Tra gli svariati metodi chimici proposti, uno dei più soddisfacenti è quello che spezza la catena nei punti adiacenti ai residui di metionina per mezzo del bromuro di cianogeno: la reazione procede in modo praticamente quantitativo e poiché in genere vi sono pochi residui di metionina in un polipeptide, con questo metodo si ottiene una miscela di peptidi relativamente semplice. In teoria, da un polipeptide contenente N residui di metionina si ottengono N+1 peptidi, ciascuno dei quali contiene un residuo di omoserina, eccettuato il frammento carbossi-terminale. Gli enzimi proteolitici possono essere endopeptidasi (come la tripsina e la chimotripsina), che attaccano la catena polipeptidica all'interno, o esopeptidasi (come la leucinamminopeptidasi e la carbossipeptidasi), che staccano amminoacidi dalle estremità della catena.Il passaggio successivo comporta la separazione dei peptidi, ottenuti chimicamente o enzimaticamente, mediante l'uso della cromatografia a scambio ionico, della gelfiltrazione o dell'elettroforesi su carta. La sequenza degli amminoacidi nei peptidi purificati viene determinata dal distacco sequenzia...

Fattori che influenzano la conformazione proteica

In realtà gli AA non si susseguono in maniera lineare ma, in uno spazio tridimensionale, si dispongono secondo un andamento a fisarmonica (struttura betafoglietto) o secondo spirali (alfaelica). Se le variazioni non sono drastiche, le proteine riacquistano le loro relative strutture native quando al ripristino delle condizioni iniziali. Le proteine, invece perdono la loro struttura primaria tramite una demolizione graduale per idrolisi catalizzata da enzimi proteolitici (pepsina, tripsina). I prodotti sono prima peptidi e infine amminoacidi.

Principali funzioni delle proteine

Alcune delle principali funzioni che le proteine possono ricoprire:

1. Possono regolare l'espressione genica.

Tabella riassuntiva dei gruppi ionizzabili

Valori normali di pKa dei gruppi ionizzabili:

Gruppo Ionizzabile	pKa
α-carbossilico	~2.0
α-amminico	~9.5
Aspartato (β-carbossilico)	~3.9
Glutammato (γ-carbossilico)	~4.3
Istidina (anello imidazolico)	~6.0
Cisteina (gruppo tiolico)	~8.3
Tirosina (gruppo fenolico)	~10.9
Lisina (ε-amminico)	~10.5
Arginina (gruppo guanidinico)	~12.5

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