Le chinasi sono una famiglia di proteine deputate alla fosforilazione di altre molecole organiche.
La fosforilazione è il trasferimento di un gruppo fosfato da una molecola donatrice al substrato specifico. La molecola da cui le chinasi prelevano il gruppo fosfato è nella maggioranza dei casi l'ATP, più raramente un GTP.
I substrati fosforilati dalle chinasi sono molti; nella maggior parte dei casi però si tratta di proteine. La fosforilazione di una proteina rappresenta il sistema più utilizzato dalle cellule per regolare una via metabolica. Attraverso l'aggiunta del gruppo fosfato le proteine possono essere attivate o disattivate.
In alcuni casi l'attivazione o la disattivazione sono dirette, in altri casi sono mediate dal legame con un'altra molecola, che può avvenire solo se la proteina target è fosforilata (regolazione positiva) o defosforilata (regolazione negativa).
Tipi di Protein Chinasi
La classe di chinasi che ha come bersaglio le proteine è la più ampia e diffusa. Questa classe di enzimi è in grado di attaccare selettivamente i residui di tirosina delle proteine bersaglio oppure uno tra i residui di Serina e Treonina.
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Le tirosina chinasi sono coinvolte nella regolazione di processi fondamentali come crescita, differenziamento, metabolismo e apoptosi. In relazione al coinvolgimento nei meccanismi apoptotici, le tirosina chinasi possono partecipare allo sviluppo ed alla eventuale risoluzione di tumori nell'organismo, per cui sono oggetto di specifiche ricerche medico-scientifiche.
Le tirosin-chinasi fosforilano il gruppo -OH delle tirosine. Un esempio di tirosin-chinasi sono i recettori dei fattori di crescita, quali il recettore dell’insulina (IGFR1, Insulin-like Growth Factor Receptor 1), il recettore del fattore di crescita dell’epidermide (EGFR, Epidermal Growth Factor Receptor) e il recettore del fattore di crescita delle piastrine (PDGFR, Platelet-Derived Growth Factor Receptor).
In seguito all’interazione con il ligando all’esterno della cellula, tali recettori si autofosforilano nella parte citoplasmatica; questo processo causa l’attivazione del recettore che, a sua volta, fosforila altri substrati intracellulari coinvolti nella trasduzione del segnale con processo a cascata.
Quando il ligando interagisce con il recettore nell'ambiente extracellulare, questo subisce una dimerizzazione e diviene capace di reclutare e legare l'ATP. Le tirosina chinasi citoplasmatiche sono anch'esse coinvolte nella regolazione di numerosi importanti processi fisiologici.
Il ruolo principale svolto da queste proteine è quello di mediare la risposta dei linfociti T e B del sistema immunitario. Il sito catalitico è formato da due lobi asimmetrici, uno più piccolo dove avviene l'interazione con l'ATP e uno più grande che lega il substrato da fosforilare.
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Al centro tra i due si colloca una fessura dove ha luogo il trasferimento del gruppo fosfato da un substrato all'altro.
L'altra grande famiglia di protein-chinasi è quella costituita dalle chinasi specifiche per la Serina e la Treonina. Questa classe di enzimi è coinvolta nella regolazione di molteplici processi, tra cui alcune fasi del ciclo cellulare.
Le serin-treonin-chinasi fosforilano il gruppo -OH delle serine o delle treonine. Esempi di serin-treonin-chinasi sono le MAP-chinasi (MAPK, Mitogen-Activated Protein Kinase), che sono in genere attivate in seguito a stimoli che inducono la mitosi.
Ciascuna delle tre tipologie di chinasi Aurora è composta da tre domini: un dominio catalitico, che mostra una sequenza molto ben conservata ove è presente il sito di legame dell'ATP e due domini regolatori posizionati in corrispondenza delle estremità N e C della proteina.
Le chinasi sono presenti in animali, piante e batteri; nell’uomo ce ne sono circa 550. Le chinasi regolano la maggior parte dei processi cellulari, soprattutto quelli coinvolti nella trasduzione del segnale, ossia la trasmissione di un determinato segnale all’interno della cellula.
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L’azione delle chinasi si svolge attraverso il trasferimento di un gruppo fosfato a una proteina. Tale processo, chiamato fosforilazione, può avere effetti diversi sul substrato, riguardanti, ad esempio, la localizzazione subcellulare, l’attività enzimatica o l’associazione con altre proteine.
Il gruppo fosfato di una proteina può essere eliminato dalle fosfatasi, enzimi che ne catalizzano la rimozione. Le chinasi stesse possono essere regolate dalla propria fosforilazione che può essere mediata da parte della chinasi.
A seconda degli amminoacidi che fosforilano, le chinasi miste e le istidin-chinasi.
Le chinasi miste fosforilano diversi residui amminoacidici; esempi di chinasi miste sono le MEK (o MAPKK) che fosforilano residui sia di serina/treonina sia di tirosina. Infine, le istidin-chinasi.
Importanza Clinica delle Protein Chinasi
Un'alterata attività delle chinasi è stata riscontrata in diversi tipi di tumori. Per questo motivo, diverse chinasi sono importanti target per lo sviluppo di farmaci antitumorali. Un inibitore di tirosin-chinasi.
Molti oncogeni (geni normalmente inattivi che, quando attivati, determinano lo sviluppo di tumori) codificano recettori mutati o altri elementi facenti parte del sistema IP3/DAG. L’effetto delle mutazioni è quello di attivare in modo permanente la via dell’IP3/DAG, dando luogo ad una risposta che determina una divisione cellulare rapida e incontrollata, caratteristica delle cellule tumorali.
Le protein chinasi sono anche implicate in malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer. La disfunzione della protein chinasi GSK-3 (glycogen synthase kinase-3) è stata collegata alla formazione di placche amiloidi e grovigli neurofibrillari, caratteristiche patologiche della malattia.
Nel diabete, la protein chinasi AMP-activated protein kinase (AMPK) svolge un ruolo cruciale nella regolazione del metabolismo energetico. AMPK è attivata in condizioni di bassa energia cellulare e promuove l’omeostasi energetica aumentando l’assorbimento del glucosio e la beta-ossidazione degli acidi grassi.
Protein Chinasi A (PKA)
La proteina chinasi A (PKA) è una delle proteine più studiate nel campo della biologia cellulare e della biochimica. Questa proteina svolge un ruolo cruciale nella regolazione di numerosi processi cellulari, tra cui il metabolismo, la trascrizione genica e la segnalazione cellulare.
La proteina chinasi A, nota anche come cAMP-dipendente proteina chinasi, è un enzima che catalizza la fosforilazione di specifiche proteine bersaglio.
La PKA è composta da due subunità regolatorie e due subunità catalitiche. Le subunità regolatorie della PKA contengono domini che legano l’AMP ciclico (cAMP), una molecola segnale secondaria. Quando il cAMP si lega alle subunità regolatorie, provoca un cambiamento conformazionale che rilascia le subunità catalitiche, attivandole.
La PKA è presente in quasi tutte le cellule eucariotiche, sottolineando la sua importanza evolutiva. La PKA svolge un ruolo centrale nella regolazione del metabolismo cellulare. Ad esempio, la PKA è coinvolta nella regolazione della glicogenolisi e della gluconeogenesi nel fegato.
Oltre al metabolismo, la PKA regola anche la trascrizione genica. La PKA può fosforilare fattori di trascrizione come CREB (cAMP response element-binding protein), che a sua volta attiva l’espressione di geni specifici.
La PKA è anche coinvolta nella modulazione della funzione sinaptica nel sistema nervoso. La fosforilazione di proteine sinaptiche da parte della PKA può influenzare la plasticità sinaptica, un processo fondamentale per l’apprendimento e la memoria.
Infine, la PKA regola numerosi altri processi cellulari, tra cui la proliferazione cellulare, la differenziazione e l’apoptosi.
Meccanismo di Attivazione della PKA
Il meccanismo di attivazione della PKA inizia con la produzione di cAMP, che è generato dall’adenilato ciclasi in risposta a segnali extracellulari come ormoni e neurotrasmettitori. Quando il cAMP si lega alle subunità regolatorie della PKA, provoca un cambiamento conformazionale che rilascia le subunità catalitiche. Questo rilascio attiva le subunità catalitiche, che possono quindi fosforilare proteine bersaglio specifiche.
La specificità del segnale è garantita dalla localizzazione della PKA all’interno della cellula. La PKA è spesso ancorata a specifiche strutture subcellulari tramite proteine di ancoraggio della PKA (AKAPs). La regolazione della PKA è complessa e coinvolge anche feedback negativi. Ad esempio, la fosfodiesterasi (PDE) degrada il cAMP, riducendo l’attivazione della PKA.
Ruolo della PKA nelle Vie di Segnalazione
La PKA è un componente chiave di molte vie di segnalazione cellulare. Una delle vie più note è la via del cAMP-PKA-CREB, che regola l’espressione genica in risposta a vari stimoli. Un altro esempio è la via di segnalazione adrenergica. Gli ormoni adrenergici, come l’adrenalina, attivano i recettori beta-adrenergici sulla superficie cellulare, che a loro volta attivano l’adenilato ciclasi.
La PKA è anche coinvolta nella regolazione del ciclo cellulare. Ad esempio, la PKA può fosforilare proteine che regolano la progressione del ciclo cellulare, influenzando la proliferazione e la differenziazione cellulare.
Infine, la PKA interagisce con altre vie di segnalazione, come la via della proteina chinasi C (PKC) e la via della MAP chinasi.
Implicazioni della PKA nelle Malattie
Le alterazioni nella funzione della PKA sono associate a varie malattie. Ad esempio, mutazioni nelle subunità regolatorie della PKA possono portare a sindromi come la sindrome di Carney, caratterizzata da tumori multipli e anomalie pigmentarie.
La PKA è anche implicata nella patogenesi del diabete di tipo 2. La disfunzione della segnalazione del cAMP-PKA può influenzare la regolazione del metabolismo del glucosio, contribuendo all’insulino-resistenza e alla iperglicemia.
Nel campo delle neuroscienze, la PKA è studiata per il suo ruolo nei disturbi neuropsichiatrici. Alterazioni nella segnalazione della PKA possono essere coinvolte in condizioni come la depressione e la schizofrenia.
Infine, la PKA è un bersaglio promettente per lo sviluppo di nuovi farmaci antitumorali. Inibitori specifici della PKA potrebbero essere utilizzati per trattare vari tipi di cancro, bloccando la proliferazione delle cellule tumorali.
Protein Chinasi C Theta (PKCθ) e Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD)
Il gruppo di ricerca italiano ha focalizzato la sua attenzione sulla protein chinasi C theta (PKCθ), un enzima che è altamente espresso nelle cellule T e che gioca un ruolo critico nella loro attivazione.
Recentemente, le potenzialità degli inibitori di PKCθ per il trattamento di disordini immunologici cronici hanno suscitato un grande interesse nella comunità scientifica. Una serie di studi hanno dimostrato che queste molecole agiscono inibendo l’attivazione dei linfociti T, portando effetti benefici sull’infiammazione.
È importante sottolineare che l’azione inibitoria di queste molecole sulle cellule T non previene la funzione protettiva della risposta immunitaria contro eventuali infezioni nei topi, il che riduce le probabilità di eventuali effetti collaterali.
Con uno studio pubblicato nel 2017, i ricercatori dell’Università Sapienza hanno dimostrato che l’inibizione farmacologica di PKCθ, condotta su giovani topi mdx (topi modello per la distrofia muscolare) dà risultati positivi, sia in termini di riduzione del danno del tessuto muscolare degli arti, sia in termini funzionali.
Il prossimo obiettivo del team di Bouché è di valutare se l’inibizione di PKCθ può essere efficace anche nel ridurre gli esiti tardivi della patologia, quali la fibrosi del diaframma e del cuore. Processi che portano ad un’insufficienza cardio-respiratoria e che sono la principale causa di morte nei pazienti Duchenne.
Studio sull'Efficacia dell'Inibizione di PKCθ nel Modello Murino mdx
In particolare, abbiamo utilizzato un inibitore della PKCθ, una protein chinasi cruciale per l’attivazione della risposta immune, il C20. Precedentemente avevamo dimostrato la sua efficacia nel prevenire gli eventi precoci della patologia, a livello del muscolo scheletrico, utilizzando nei topi mdx. Con questo progetto, sempre nello stesso modello animale, abbiamo voluto indagare la sua efficacia nel prevenire le complicazioni cardio-respiratorie tardive della DMD.
Risulta evidente da queste considerazioni, e in assenza di una cura definitiva, la necessità di cercare approcci antinfiammatori differenti, più specifici e con meno effetti collaterali. A tal proposito, il nostro gruppo di ricerca ha precedentemente sperimentato con successo un approccio farmacologico basato sull’inibire specificamente una proteina presente nei linfociti T, chiamata PKC theta.
Questa proteina risulta importante nell’attivazione di queste cellule, che giocano un ruolo di “pilota”, organizzando e indirizzando le altre cellule immunitarie. L’inibitore specifico della PKC theta, chiamato C20, è risultato efficace nel prevenire il danno ai muscoli degli arti inferiori di un modello animale di DMD, il topo mdx.
Risultati dello Studio
Durante il primo anno di finanziamento abbiamo intrapreso una caratterizzazione dettagliata dell’andamento della fibrosi e dell’infiltrato infiammatorio nel diaframma e nel cuore in topi mdx di diverse età, da 1 a 11 mesi di età.
Per quel che riguarda il diaframma, il tessuto fibrotico si accumula già precocemente, a 1 mese di età, e aumenta con l’aumentare dell’età e la progressione della patologia, fino a rappresentare più del 50% dell’organo a 11 mesi di età, il che presumibilmente dovrebbe alterarne la funzionalità. Abbiamo inoltre osservato un picco di infiltrato infiammatorio a 1 mese di età, del tutto simile a quello precedentemente osservato nel muscolo delle zampe, che poi si riduce a livelli paragonabili a quelli osservati in animali non distrofici.
Nel cuore, la fibrosi comincia a essere evidente più tardi, a partire dai 6 mesi di età, e aumenta progressivamente, anche se non raggiunge livelli particolarmente elevati. Anche in questo organo abbiamo osservato un picco di infiltrato infiammatorio a 1 mese di età e uno successivo a 11 mesi.
Considerando la tardiva insorgenza della fibrosi cardiaca nel topo mdx, abbiamo progettato un protocollo di esercizio forzato in stile “cardio”, mirato a far lavorare il cuore e di conseguenza accelerarne il decorso patologico. Infatti, il topo mdx è un modello geneticamente molto aderente alla DMD, ma presenta una patologia cardiaca più lieve e tardiva rispetto ai pazienti.