La necessità di contenere la pandemia di COVID-19, attraverso lo sviluppo di terapie e vaccini, e di capire come il nostro sistema immunitario risponda all’infezione di SARS-CoV-2 (di seguito indicato con CoV-2) è estremamente urgente.
Risposta Immune e Gravità della Malattia
Di rilievo è l’osservazione che i casi più gravi di COVID-19 presentano una risposta immune eccessiva, caratterizzata da linfopenia, eosinopenia, attivazione di cellule secernenti citochine e conseguente tempesta citochinica, risultante in una sindrome da distress respiratorio acuto (ADSR, Acute Distress Respiratory Syndrome), danno tissutale, coagulazione intravasale disseminata e collasso multiorgano.
I pazienti con COVID-19 sono affetti in maniera ricorrente da quella che è chiamata tempesta di citochine, con manifestazioni cliniche sovrapponibili a quelle della linfoistiocitosi emofagocitica secondaria (sHL, secondary Haemophagocytic Lymphohisiocytosis), una sindrome iperinfiammatoria, di solito scatenata da infezioni virali, caratterizzata da febbre persistente, iperferritinemia, citopenia e ADRS nel 50% dei casi.
Un tipico profilo di citochine osservato nei pazienti con COVID-19 mostra alti livelli di interleuchina 2 (IL2), IL6, IL7, fattore stimolante i granulociti (GCS-F, Granulocyte Colony Stimulating Factor), proteina 10 inducibile da IFNγ (IP10, IFNγ inducible Protein 10), proteina chemoattraente 1 dei monociti (MCP1, Monocyte Chemoattractant Protein 1), proteina infiammatoria 1-α dei macrofagi (MIP1-α, Macrophage Inflammatory Protein 1-alpha,) e il fattore α di necrosi tumorale (TNFα, Tumor Necrosis Factor alpha).
Proteine della Fase Acuta come Marcatori
Le proteine della fase acuta, che insorgono all’inizio del processo infiammatorio, dovuto ad agenti infettivi o meno, possono essere marcatori diagnostici e prognostici di malattia.
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Nei pazienti con COVID-19, questi indicatori molecolari sono stati costantemente riportati alla diagnosi e correlati con la gravità della malattia insieme ad altri marcatori, tra cui troponina I cardiaca, procalcitonina, aumento del tempo della protrombina, ferritina, D-dimero (un prodotto di degradazione della fibrina, digerita dall’enzima plasmina), fibrinogeno, aspartato transaminasi (AST) e aumento del tempo di sedimentazione degli eritrociti.
Interferoni: Un'arma a Doppio Taglio?
Gli interferoni sono classificati in 3 sottotipi, alfa (α), beta (β) e gamma (γ). Gli interferoni α e ß appartengono alla sottoclasse tipo 1, mentre l’interferone γ fa parte della sottoclasse tipo 2. Date le loro proprietà antivirali, sono state esplorate terapie e profilassi basate sugli interferoni. In particolare, gli interferoni α e β sono stati usati per trattare le epatiti C e B, e i dati preliminari mostrano che potrebbero essere efficaci nel prevenire l’infezione da CoV-2.
Tuttavia, gli interferoni di tipo 1 hanno effetti collaterali considerevoli, a causa dell’espressione ubiquitaria dei loro recettori. Al contrario, l’interferone λ è espresso da cellule epiteliali e immunitarie e gli studi svolti finora hanno dimostrato che è in grado di prevenire la disseminazione virale dall’epitelio nasale al tratto respiratorio superiore.
Inoltre, l’interferone λ è una molecola protettiva più che infiammatoria, e stimola sia l’immunità adattativa sia la produzione di anticorpi, essenziali per l’immunità a lungo termine. Perciò, potrebbe avere effetti benefici sui pazienti con COVID-19.
Comunque, le cellule stimolate con l’interferone λ aumentano l’espressione della GBP5 (Guanylate Binding Protein 5), una proteina che inibisce l’attività della furina e la propagazione virale dalle cellule infette.
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Inoltre, è stato provato che gli interferoni di tipo 1 e 2 possono indurre l’espressione di ACE2 in colture di cellule umane del tratto respiratorio superiore e in cellule primarie dell’epitelio basale di donatori umani. Questi risultati suggeriscono che il CoV-2 potrebbe usare gli interferoni per aumentare la sua capacità infettiva.
Se gli interferoni siano vantaggiosi o dannosi per i pazienti con COVID-19 è un argomento ancora in discussione.
Il Ruolo del Sistema HLA
Il sistema HLA è costituito da proteine di superficie che riconoscono ciò che è proprio (self) da ciò che non lo è. Queste proteine sono divise in due classi (I e II). La classe I è espressa da tutte le cellule nucleate, mentre la classe II è espressa da cellule specializzate, chiamate cellule presentanti l’antigene (APC, Antigen Presenting Cell).
Secondo la nomenclatura del Comitato per i fattori del sistema HLA dell’Organizzazione Mondiale della Sanità, i geni del sistema HLA sono indicati con HLA- seguito da una lettera o una sigla (A, B, C, DR ecc.) che indica il gene, un asterisco, un numero che indica l’allele, il segno dei due punti e un secondo numero che indica la proteina specifica (per esempio, HLA-A*02:02 indica gene nel locus A, allele 2, proteina 2).
Alleli HLA differenti conferiscono una suscettibilità diversa al CoV-2 e determinano un esito differente della malattia, come accade anche per il SARS-CoV.
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La comparazione con i proteomi di altri CoV ha mostrato che i migliori alleli che danno luogo a proteine presentanti peptidi conservati, e potenzialmente in grado di conferire immunità protettiva crociata, sono HLA-A*02:02, HLA-B*15:03 e HLA-C*12:03.
Al contrario, gli alleli HLA-A*25:01, HLA-C*01:02 and HLA-B*46:01 sono i peggiori, e l’ultimo è anche associato a un decorso di malattia più grave nel caso di infezione da SARS-CoV.
Riguardo le proteine HLA di classe II, l’HLA-DR merita una menzione speciale. L’HLA-DR è espressa sulla superficie dei monociti, come cellule dendiritiche, linfociti B e macrofagi.
Quando presenta i peptidi derivati da patogeni ai linfociti T CD4+ e CD8+ si scatena una risposta immunitaria specifica. Inoltre, le molecole HLA-DR attivano i linfociti T helper, che svolgono un ruolo centrale nella risposta immunitaria contro gli agenti virali.
Le molecole HLA-DR sono meno espresse sulla superficie dei monociti CD14+ dopo un’infezione da CoV-2, come durante la sepsi. Quando il numero di monociti HLA-DR+ cala, la polmonite evolve in collasso respiratorio grave, che richiede ventilazione meccanica.
Interleuchina 6 (IL6) e la sua influenza
La famiglia delle IL6 esercita molte funzioni, incluse l’attivazione dei linfociti B, ma sono anche coinvolte nel controllo metabolico e neurotrofico. Nei pazienti con COVID-19, l’IL6 è prodotta principalmente da monociti CD14+ e linfociti T CD4+.
Esiste una correlazione negativa tra i livelli di IL6 e il numero di molecole HLA-DR sulla superficie di monociti CD14+, ed esiste anche una correlazione tra il numero assoluto di monociti CD14+ e il numero assoluto di linfociti, che sono frequentemente diminuiti nei pazienti con COVID-19 gravi.
Attivazione dei Linfociti T
In particolare, i linfociti T CD4+ sono attivati quando i PBMC sono esposti a epitopi della proteina spike (S), meno da epitopi della proteina di membrana (M) e del nucleocapside (N). Le cellule CD8+ sono attivate da epitopi derivati da M ed S, con almeno altre otto cornici di lettura aperte (ORF, Open Reading Frame).
Inoltre, i pazienti con COVID-19 producono anticorpi anti-S a livelli corrispondenti all’ampiezza dell’attivazione dei linfociti T CD4+ specifici per S, e anche le risposte dei linfociti T CD4+ e CD8+ sono ben correlate.
Infine, in linea e in supporto di quanto detto nel paragrafo precedente, in merito a un’immunità protettiva crociata, nel 40-60% degli individui non esposti, sono stati riscontrati linfociti T CD4+ contro CoV-2.
Anticorpi e Immunità Umorale
Gli anticorpi (Ab), o immunoglobuline (Ig), sintetizzati da linfociti B e plasmacellule, rappresentano la nostra risposta umorale ai patogeni. Le immunoglobuline sono classificate in diversi tipi a seconda della loro struttura (IgA, IgD, IgG, IgE, IgM).
Gli anticorpi compaiono da 5 a 10 giorni dopo l’insorgenza dei sintomi. Curiosamente, e a supporto della grande importanza della risposta umorale per contrastare il COVID-19, in età pediatrica, in cui si osservano una minor suscettibilità all’infezione e sintomi più lievi, sono stati rilevati alti livelli di IgG entro la prima settimana dopo la manifestazione della malattia, con IgM praticamente nulle, indicando una sieroconversione molto rapida da IgM ad IgG.
Usando il dominio di legame al recettore (RBD, Receptor Binding Domain) di S come esca, sono stati isolati i linfociti B memoria da pazienti con COVID-19 guariti e quattro anticorpi prodotti da queste cellule si sono dimostrati efficaci nel legare l’RBD di CoV-2 ma non di SARS-CoV-2. Tra questi anticorpi, due (H4 e B28) hanno mostrato attività neutralizzante, cioè, impediscono il legame di S ad ACE2.
In particolare, all’interfaccia B38-RBD sono impiegati 18 dei 21 amminoacidi coinvolti nel legame ACE2-RBD, il che spiega perché il B38 blocca il legame di COV-2 ad ACE2.
L’entità della risposta anticorpale dipende dall’entità della malattia. Più gravi sono le condizioni cliniche dei pazienti, più elevato è il titolo anticorpale. Basti pensare che questo è di 3000 volte più alto nei pazienti ospedalizzati che non in quelli in sorveglianza domiciliare o nei donatori di plasma convalescente. La stessa attività neutralizzante degli anticorpi è più elevata nei malati gravi rispetto a quelli lievi.
È stato anche osservato che a un basso livello anticorpale corrisponde un perdurare della positività all’RNA virale nei casi di malattia lieve.
Per quanto riguarda la durata, la letteratura scientifica è concorde nell’affermare che l’immunità umorale contro il SARS-CoV-2 si esaurisce nell’arco di 2-3 mesi. Tuttavia, la stimolazione di linfociti T e B garantisce l’acquisizione di un’immunità cellulare.
Di particolare rilievo è la recente scoperta che anche le persone che non sono state infettate o che non sono state in contatto con malati di COVID-19 o infetti da SARS-CoV-2, possiedono linfociti T memoria stimolati da e specifici per il SARS-CoV-2, che riconoscono la proteina del nucleocapside (N) di SARS-CoV e le proteine non strutturali nsp7, 13 ed N di altri β-coronavirus. Ciò suggerisce che l’incontro occasionale con altri β-coronavirus, incluso SARS-CoV, induce un’immunità cellulare specifica contro il SARS-CoV-2.
Recentemente, circa 30 000 pazienti precedentemente affetti da COVID-19, e potenziali donatori di plasma convalescente, sono stati analizzati per la quantità e persistenza di anticorpi contro CoV-2. Questa analisi ha evidenziato un titolo variabile di anticorpi, con le persone che possedevano titoli più alti caratterizzati anche da una maggior quantità di anticorpi neutralizzanti.
Cosa più importante, gli anticorpi individuati perduravano per tutto il tempo dell’osservazione (5 mesi, da aprile a ottobre 2020), suggerendo, quindi, una persistenza dell’immunità umorale oltre i 2-3 mesi stimati in precedenza.
Inoltre, è stata dimostrata la presenza di cellule memoria sia B sia T che suggeriscono la formazione di una memoria immunitaria persistente.
Linfopenia e Altri Parametri
Nella letteratura sono stati riportati molti casi in cui si è osservata una linfopenia nei pazienti con COVID-19 in condizione critica, che colpisce soprattutto i linfociti T, inclusi i linfociti T regolatori (Treg, che giocano un ruolo importante nel limitare risposte immunitarie eccessive).
Il decremento del numero dei linfociti può essere usato come marcatore diagnostico e prognostico per la COVID-19.
In effetti, i pazienti con linfociti T più alti del 20%, a 10-12 giorni dalla comparsa dei sintomi sono stati classificati come lievi-moderati; al contrario, nella stessa finestra temporale, i pazienti con linfociti T più bassi del 20% sono stati classificati come gravi.
A circa 20 giorni dalla diagnosi, i pazienti con più del 20% di linfociti T sono stati dichiarati in fase di recupero; i pazienti con una percentuale di linfociti T tra il 5 e il 20% sono stati classificati ad alto rischio, laddove i pazienti con una percentuale di linfociti T inferiore al 5% sono stati dichiarati critici.
Nei PBMC da pazienti con COVID-19 è stata osservata un’attivazione della proteina p53, suggerendo che i linfociti T potrebbero diminuire per apoptosi.
La linfopenia potrebbe anche dipendere dalla carica virale alla quale una persona è esposta. Le basse cariche virali possono indurre una risposta dei linfociti B e T appropriata e la comparsa di anticorpi neutralizzanti, risultante nell’eliminazione del virus.
Un altro parametro da tenere in considerazione è la conta degli eosinofili. Gli eosinofili agiscono nella risposta immunitaria adattativa e producono molecole antivirali. Inoltre, servono come APC contro i virus respiratori. Un numero costantemente ridotto di eosinofili è stato osservato nei pazienti con COVID-19, quando comparato con quello di pazienti affetti da polmonite.
Il basso numero di Treg non è sufficiente a contrastare la risposta immunitaria eccessiva, in quanto potenziano questa deregolazione.
La quantità della carica virale è importante nel determinare la gravità della malattia, contro la quale, tuttavia, l’organismo è in grado di indurre, in maniera robusta, una risposta umorale e mediata dalle cellule T.
Citochine e Interferoni
Le citochine sono proteine che non hanno una specificità antigenica, prodotte da un’ampia varietà di cellule (per esempio, da periciti, astrociti, cellule epiteliali, endoteliali e muscolari) e anche da cellule immunitarie. Sotto stimolo da citochine, una cellula può proliferare, differenziare o persino morire.
Gli interferoni sono citochine prodotte da cellule tissutali, leucociti e anche da cellule tumorali.
Meccanismi di Danno Vascolare e Ruolo della Proteina Spike
Uno dei più recenti ha messo in luce il ruolo della proteina spike in questo fenomeno. SARS-CoV-2 è stato spesso rappresentato come un riccio ricoperto di aculei, le proteine spike, appunto, che si legano alle cellule attraverso un recettore presente sulla membrana di queste ultime, chiamato ACE2 [4]. Il lavoro pubblicato su Circulation Research mostra che il danno alle superfici interne dei vasi sanguigni, dette endoteli, può essere provocato da questa proteina da sola, anche senza il materiale genetico necessario per infettare le cellule. Ma sottolinea anche che, perché questo fenomeno avvenga, è indispensabile l’interazione tra la proteina spike e il suo recettore ACE2. Non è insomma un danno meccanico, come si potrebbe superficialmente pensare guardando le immagini in cui il virus scorre nel sangue con tutte le sue punte esposte.
Vaccini a mRNA: Un Nuovo Approccio
La miglior notizia di questi ultimi mesi è l’allestimento in tempo record di vaccini straordinariamente efficaci basati sulla tecnologia di inoculazione di un semplice RNA messaggero (mRNA) incapsulato in nanoparticelle lipidiche che lo proteggono dalla degradazione e fungono da adiuvanti per potenziare la risposta immunitaria.
Ai due vaccini basati su mRNA prodotti da Pfizer/BioNtech e Moderna si è poi aggiunto, in Europa, il vaccino di AstraZeneca, basato sull’espressione della proteina spike con la metodologia più tradizionale dei vettori adenovirali e, a breve, è atteso l’inizio della vaccinazione con un vaccino simile (ma che richiede una sola dose) prodotto dalla Johnson & Johnson.
A differenza dei vaccini di concezione precedente, non contengono il virus attenuato o inattivato, né le sue proteine purificate, ma soltanto un frammento di mRNA sintetico. Tale frammento contiene le istruzioni utili alle cellule umane per costruire copie di una porzione della cosiddetta proteina “spike”, ossia quella che il virus SARS-Cov-2 usa come una sorta di uncino per agganciarsi alle nostre cellule e penetrarvi per poi moltiplicarsi. Sfruttato il processo con cui le nostre cellule producono le proteine, questi vaccini di nuova generazione riescono a stimolare le difese del nostro sistema immunitario.