Siamo parte integrante della natura vibratoria dell'Universo, comprendente vibrazioni meccaniche (udibili e non), campi magnetici e radiazioni elettromagnetiche (luce). Robuste evidenze sperimentali dimostrano come le nostre cellule producano e percepiscano campi magnetici e oscillazioni meccaniche. Queste ultime sono comprese sia all’interno della gamma udibile o subsonica di una vibrazione.
Il riconoscimento biomolecolare è anche indissolubilmente legato alla natura oscillatoria delle componenti subcellulari. Siamo inclini a pensare che le molecole debbano interagire come una chiave in una serratura per scatenare una risposta cellulare.
Tuttavia, questa eventualità rappresenta soltanto una delle modalità con cui la trasduzione molecolare del segnale diviene operativa. Vi è assoluta evidenza che le reazioni cellulari mostrino caratteristiche di tempestività e di connessione ad ampio raggio che accadono con velocità troppo elevate per poter essere spiegate esclusivamente sulla base di una semplice diffusione molecolare nell’ambiente acquoso intra-cellulare.
La maggior parte delle molecole d’acqua è associata a strutture subcellulari, che sono costantemente in movimento, oscillanti, come il citoscheletro e il nucleoscheletro, formando una sorta di network tessile che ingloba il nucleo, i mitocondri e il reticolo endoplasmatico, creando seri problemi ad un traffico meramente diffusivo di molecole segnale.
A quale altra visione della generazione e propagazione delle informazioni biologiche possiamo attingere sulla base delle più recenti conoscenze? Se pensiamo alle proteine cellulari in termini fisici, possiamo vedere come alcuni dei loro motivi altamente conservati e ripetuti, quali strutture ad alfa-elica e le anse che connettono le alfa-eliche tra loro, siano rispettivamente assimilabili ad un sistema di molle e connettori, in grado di rendere una singola proteina capace di vibrare in una sorta di risonanza di fase.
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Questo oscillatore (la proteina) è come un metronomo, che grazie alla presenza di motori molecolari come kinesine o dineine, è in grado di muoversi lungo il cito-nucleo-scheletro, dove i microtubuli agiscono come una rete elastica dissipativa delle principali differenze ritmiche tra i vari oscillatori che compongono l’insieme delle molecole segnale.
Questo contesto facilita e promuove il raggiungimento di fasi di sincronizzazione attraverso stadi evolutivi degli andamenti vibrazionali di ciascun oscillatore (molecola segnale) che, grazie alla rete di microtubuli con cui interagisce, diventa consapevole di quanto sta avvenendo nel sistema, per la sua intrinseca connettività.
Tale approccio ci sta aiutando ad indagare come andamenti oscillatori multipli siano in grado di condividere informazioni. I microtubuli cellulari, a causa delle loro modalità intrinseche di vibrazione e polarità elettrica, sono ora considerati come un sistema in grado di generare campi elettrici ad alta frequenza con caratteristiche di irraggiamento.
Questo campo oscillante appare essere di grande importanza per l’organizzazione intracellulare e l’interazione intercellulare. In una gran varietà di cellule è stata sperimentalmente rilevata una attività elettrodinamica nella regione di frequenze comprese fra kHz e GHz, dimostrando come i microtubuli siano la fonte di tale attività.
I microtubuli possono essere quindi visti come dispositivi in grado di memorizzare ed elaborare informazioni, un pò come uno switch della flash memory nel chip di un computer. La capacità delle cellule di generare e modulare campi elettromagnetici è anche il fondamento per considerare la possibilità di dirigere il destino cellulare mediante energie fisiche.
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In questo contesto, è stato evidenziato per la prima volta che l’esposizione di cardiomiociti ventricolari adulti a campi magnetici di frequenza estremamente bassa (ELF-MF) ha portato alla modulazione trascrizionale di un sistema endorfinergico di molecole segnale, che è stato precedentemente dimostrato essere essenziale nella regolazione della crescita miocardica, degli andamenti oscillatori del calcio intracellulare e della sensibilità dei miofilamenti al calcio, elemento quest’ultimo fondamentale nella regolazione della contrattilità miocardica.
Adesione Cellulare e Riconoscimento
La costituzione di organismi pluricellulari richiede la loro aggregazione in masse che, durante le fasi dello sviluppo embrionale, formeranno tessuti e organi. Il riconoscimento e l'adesione tra cellule sono controllati da 'recettori adesivi', proteine della membrana cellulare appartenenti alle famiglie delle caderine, delle Cell adhesion molecules (CAM) e delle integrine.
I recettori adesivi appartenenti alle tre famiglie sono proteine che attraversano la membrana plasmatica della cellula da parte a parte; essi sono costituiti da tre porzioni distinte: una rivolta all'esterno della cellula, una che attraversa il doppio strato lipidico della membrana e una terza porzione che si affaccia nel citoplasma all'interno della cellula.
Nel caso delle caderine e delle CAM, la porzione rivolta all'esterno della cellula può legare molecole identiche a sé stessa presenti sulla membrana di cellule adiacenti, permettendo così la formazione di aggregati cellulari. Nel caso delle integrine, la porzione esterna lega proteine della matrice extracellulare, ancorando così le cellule a questa impalcatura di supporto esterna.
La funzione adesiva di questi recettori richiede, tuttavia, anche la loro interazione con le impalcature di supporto intracellulari. Questa funzione è svolta dalle porzioni dei recettori rivolte verso il citoplasma che legano diversi elementi del citoscheletro.
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L'analisi molecolare ha evidenziato l'esistenza di un grande numero di recettori adesivi e ciascuna delle tre famiglie è costituita da decine di recettori differenti. Ogni recettore è assimilabile a una chiave capace di aprire una serratura specifica. Infatti, ciascuna caderina si lega solamente a una caderina identica a sé stessa, ma non alle caderine della stessa famiglia.
Lo stesso concetto si applica ai singoli recettori delle altre due famiglie. Poiché ogni recettore è espresso in modo differenziale nel tempo e nello spazio durante lo sviluppo dell'organismo, questo sistema funziona da codice di riconoscimento basato sulla presenza di una determinata combinazione di recettori adesivi sulla superficie della cellula.
In seguito all'interazione cellula-cellula o cellula-matrice extracellulare, i recettori adesivi attivano circuiti biochimici di reazioni intracellulari che modificano sia l'organizzazione del citoscheletro sia la risposta cellulare a stimoli differenziativi e proliferativi.
La capacità delle cellule appartenenti a uno stesso tessuto di riconoscersi è stata suggerita inizialmente da una serie di esperimenti di aggregazione cellulare: quando cellule provenienti da tessuti differenti venivano mescolate in un mezzo adeguato, esse si aggregavano in agglomerati contenenti tipi cellulari omogenei.
La capacità delle cellule di riconoscersi e di aggregarsi veniva meno se cellule isolate erano trattate con enzimi proteolitici, quali la tripsina o la pronasi, che rimuovono le proteine presenti sulla superficie cellulare. Questo indica che il riconoscimento e l'aggregazione cellulare richiedono l'interazione tra proteine specifiche poste sulla membrana e definite genericamente 'recettori di adesione'.
Meccanismi Molecolari di Riconoscimento Cellulare
Lo studio di queste proteine ha permesso di comprendere che esistono almeno tre differenti meccanismi molecolari di riconoscimento tra le cellule: un meccanismo basato su interazioni omofiliche, in cui il recettore di una cellula lega un recettore uguale a sé stesso sulla cellula adiacente; quello eterofilico, che si verifica quando i recettori che mediano l'interazione tra cellule adiacenti sono di tipo differente; quello mediato da una molecola bifunzionale che fa da ponte tra due recettori su cellule adiacenti.
Caderine: Adesione Cellulare Specifica
Le caderine costituiscono una famiglia comprendente una ottantina di molecole distinte, con una distribuzione tissutale caratteristica. La E-caderina (epiteliale), la prima molecola di questa famiglia a essere stata descritta, è espressa molto precocemente durante lo sviluppo embrionale, allo stadio di morula, dove è responsabile della reazione di compattazione, processo mediante il quale le cellule dello strato esterno della morula formano tra loro delle giunzioni, sigillando la struttura.
Questo è uno dei fenomeni più precoci dello sviluppo embrionale in cui un processo di adesione cellulare permette l'organizzazione di cellule in strutture specifiche. Oltre alla E-caderina, sono state identificate diverse altre molecole di adesione appartenenti a questa famiglia, tra cui le P- e le N-caderine, presenti rispettivamente nella placenta e nel tessuto nervoso, e le VE- e le M-caderine, presenti in modo selettivo nell'endotelio vasale e nel muscolo striato.
Le caderine sono glicoproteine che attraversano la membrana da parte a parte e che presentano, nella porzione di molecola esposta al mezzo esterno, cinque moduli strutturali ripetuti, stabilizzati dal legame con ioni Ca2+. Nel modulo più esterno, verso l'estremità amminoterminale di molte caderine, è presente una sequenza di tre amminoacidi, istidina-alanina-valina, che interviene nel processo di riconoscimento omofilico tra caderine e quindi è importante per la funzione adesiva di questi recettori.
Il legame omofilico e l'espressione di tipi differenti di molecole di adesione rappresentano, quindi, meccanismi che garantiscono la segregazione delle cellule in gruppi omogenei. Tuttavia, per generare un'adesione stabile, è necessaria anche la regione citoplasmatica della proteina.
Questa porzione della caderina interagisce con i filamenti di actina del citoscheletro contrattile della cellula tramite tre proteine chiamate α-, β- e γ-catenina. L'interazione delle caderine con il sistema citoscheletrico è indispensabile per trasmettere la forza meccanica dell'adesione.
Molecole CAM: Adesione Indipendente dal Calcio
Un secondo importante sistema di recettori di adesione cellulare è rappresentato dalle molecole CAM, che mediano il riconoscimento e l'adesione tra cellule grazie a legami di tipo omofilico indipendenti dagli ioni Ca2+. La prima molecola di questo gruppo a essere identificata è stata la N-CAM (Neural cell adhesion molecule), espressa principalmente sulle cellule nervose.
N-CAM è costituita da moduli strutturali proteici di tipo immunoglobulinico e di tipo III della fibronectina (FN), una proteina della matrice extracellulare. N-CAM è codificata da un gene unico che, tuttavia, può generare differenti forme proteiche mediante un meccanismo di splicing alternativo.
Una di queste è una forma solubile, non legata alla membrana in quanto priva dei tratti transmembrana e citoplasmatico. Come tutte le proteine di membrana, N-CAM è una glicoproteina, tuttavia il suo grado di glicosilazione può variare considerevolmente.
Infatti, N-CAM può portare, legate alla regione extracellulare, quantità variabili di catene oligosaccaridiche ricche di acido sialico, in grado di regolare la sua funzione adesiva. L'alto contenuto di acido sialico, grazie all'abbondanza di cariche negative che generano forze repulsive, ostacola l'interazione omofilica; e infatti le forme di N-CAM ricche in acido sialico sono presenti prevalentemente durante le prime fasi dello sviluppo embrionale, quando sono in atto notevoli processi di migrazione cellulare, e scompaiono con il progredire dello sviluppo, quando le cellule cominciano a organizzarsi in tessuti e formano legami stabili.
Questa proteina può quindi fungere da recettore adesivo o repulsivo in funzione del grado di glicosilazione o dello splicing alternativo; ciò suggerisce che queste modificazioni proteiche siano utilizzate dalla cellula per regolare i processi di adesione. Durante lo sviluppo, la molecola N-CAM media l'adesione omofilica tra le cellule nervose.
Le molecole CAM, tuttavia, rappresentano un gruppo molto numeroso ed eterogeneo di recettori di adesione e alcune di esse mediano interazioni di tipo eterofilico. Tra queste ricordiamo ICAM-1 (Intercellular adhesion molecule-1), e VCAM (Vascular cell adhesion molecule) che legano recettori della famiglia delle integrine e che mediano il riconoscimento tra l'endotelio vasale e i leucociti nella risposta infiammatoria.
Matrice Extracellulare e Collageni
L'organizzazione dei tessuti richiede, oltre ai legami cellula-cellula, anche interazioni delle cellule con la matrice extracellulare. Quest'ultima è particolarmente abbondante nei tessuti connettivi dove, al contrario degli epiteli, le cellule non sono in stretto contatto tra loro.
Le proteine principali che costituiscono questa struttura extracellulare sono i 'collageni', la fibronectina e le laminine, molecole proteiche che presentano una struttura fibrosa e sono capaci di interazioni reciproche, garantendo in tal modo la formazione di un reticolato di supporto meccanico per i tessuti.
Sono molecole costituite solitamente da tre catene polipeptidiche ricche di prolina e di glicina e avvolte a elica, in modo da formare una molecola allungata e rigida. Sono state identificate circa 25 catene polipeptidiche differenti, che si possono combinare generando 15 tipi di collagene, i quali presentano proprietà e distribuzione tissutale specifiche.
Le molecole dei collageni di tipo I e III polimerizzano spontaneamente formando lunghe fibre, estremamente resistenti alla trazione meccanica. Le molecole di collagene presentano siti capaci di interagire con altre molecole della matrice, quali la fibronectina (collageni di tipo I e III), le laminine (collagene tipo IV) e i proteoglicani.
Il reticolato di fibre collagene e la sua interazione con le cellule sono rafforzati ulteriormente dalla presenza di molecole quali la fibronectina e le laminine. La fibronectina è una proteina fibrosa costituita da due catene polipeptidiche legate tra loro da due ponti disolfuro all'estremità carbossiterminale.
Entrambe le catene contengono tre siti di legame: uno per il collagene, un secondo per un recettore presente sulla membrana cellulare e un terzo per l'eparina, un glicosamminoglicano della matrice. Pur esistendo un unico gene, mediante un meccanismo di splicing alternativo la fibronectina viene prodotta in forme diverse, che differiscono per corti tratti di sequenza. Queste forme sono espresse in momenti differenti dello sviluppo e in tessuti diversi dell'organismo, suggerendo ruoli specifici per le singole forme.
Come nel caso dei collageni, esistono diverse catene polipeptidiche che, associandosi in varie combinazioni, formano almeno 10 tipi di laminine presenti in tessuti differenti. Inoltre, anche le laminine possiedono siti di interazione con il collagene e legano recettori cellulari.
In associazione con il collagene di tipo IV le laminine formano reticolati planari, noti come 'lamine basali', che fungono da ancoraggio per gli epiteli; inoltre queste lamine basali avvolgono in modo continuo e sostengono meccanicamente le cellule nervose e muscolari; nel glomerulo renale, oltre alla funzione di sostegno, la lamina basale, posta tra l'endotelio capillare e i podociti, svolge una funzione particolare di controllo della filtrazione del sangue.
Un altro componente importante delle matrici extracellulari è rappresentato dai proteoglicani, proteine complessate in modo stabile con glicosamminoglicani, lunghe molecole polisaccaridiche acide. Questi polimeri interagiscono con siti specifici presenti sulla fibronectina, sulle laminine e sui collageni, stabilendo così un'associazione con gli altri componenti della matrice.
Esistono differenti tipi di glicosamminoglicani, accomunati dalla proprietà di essere molecole idrofile ricche di cariche negative e, pertanto, estremamente avide di acqua e di cationi. Le proprietà e le caratteristiche fisico-chimiche della matrice extracellulare possono differire enormemente a seconda dei tessuti.
Ciò dipende dai rapporti quantitativi tra i vari componenti e dalla presenza di forme specifiche di collageni, fibronectina e laminine, nonché dalla presenza di altre proteine, quali la trombospondina, la vitronectina, l'entactina o la tenascina.
Integrine: Ancoraggio alla Matrice Extracellulare
Le cellule si ancorano alla matrice extracellulare utilizzando particolari recettori noti come 'integrine', glicoproteine che attraversano la membrana da parte a parte, mettendo in connessione la matrice extracellulare con il citoscheletro, che rappresenta il sistema di filamenti intracellulari preposto al movimento cellulare.
Le integrine sono state scoperte negli anni Ottanta del XX sec. grazie a studi finalizzati all'identificazione del recettore della fibronectina; costituito da due subunità glicoproteiche, α e β, associate in modo non covalente sulla membrana cellulare, il recettore della fibronectina ha una massa molecolare di circa 260 kDa ed è capace di legare la sequenza amminoacidica minima, arginina-glicina-acido aspartico, della fibronectina stessa.
Questa proprietà è comune a diverse integrine. Attualmente sono conosciute 18 subunità α e 8 subunità β che si associano formando 24 integrine dimeriche con attività recettoriale per differenti ligandi. La complessità della famiglia delle integrine è ulteriormente accresciuta dalla presenza di diverse isoforme di subunità α e β generate per splicing alternativo e con distribuzione tissutale e attività funzionale specifica.
Le subunità α sono caratterizzate dalla presenza, nella porzione amminoterminale esposta all'ambiente extracellulare, di tre moduli strutturali ripetuti, omologhi ai cosiddetti 'motivi strutturali EF' in grado di legare cationi bivalenti, presenti in proteine che legano il Ca2+, come la calmodulina.
Cationi bivalenti, quali Ca2+, Mg2+ e Mn2+, sono infatti indispensabili al legame integrina-proteina della matrice (ligando). Alcune subunità β presentano inoltre, in prossimità delle sequenze che legano i cationi, un tratto di sequenza definito 'modulo I', responsabile del legame al ligando.
Sono, infatti, le subunità α a determinare la specificità di legame, come indicato dal fatto che integrine che legano differenti proteine della matrice condividono la subunità β ma presentano subunità α distinte.
Una caratteristica importante delle integrine è la bassa affinità con cui legano i rispettivi ligandi. Questa proprietà è in contrasto con l'elevata affinità di legame che caratterizza la maggior parte dei recettori; la bassa affinità di legame è tuttavia fondamentale per le integrine, che, durante la migrazione cellulare, devono stabilire interazioni dinamiche con la matrice: se l'affinità fosse elevata le cellule rimarrebbero in contatto stabile con la matrice, senza potersi muovere su questa.
Una seconda proprietà importante delle integrine è quella di poter regolare il proprio stato di attivazione. Gli stimoli che giungono alla cellula possono agire, attraverso una serie di reazioni intracellulari, sulla conformazione spaziale dell'integrina: in tal modo, la proteina assumerà o una conformazione attiva, e potrà interagire con il ligando, o una conformazione inattiva, che non permetterà che tale evento si verifichi.
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