Le proteine rivestono un ruolo cruciale nell’industria farmaceutica e alimentare. Nell’ambito delle biotecnologie, ad esempio, vengono impiegati principi altamente purificati nella lotta contro le malattie. Nel campo dell’industria alimentare, questi principi sono prevalentemente utilizzati come ingredienti per alimenti destinati a bambini e sportivi.
Omogeneizzazione
Dopo l'omogeneizzazione abbiamo quello che viene chiamato estratto crudo o grezzo, che contiene tutti i componenti cellulari. Si tratta di rompere le cellule per rilasciare le proteine. Ecco alcuni metodi:
- Metodo frizionale solido: In un mortaio, il composto viene sottoposto a macinazione con sabbia o polvere di quarzo.
- Shock osmotico e di pH: Si rompono le cellule tramite variazioni osmotiche e di pH.
- Congelamento/scongelamento: Alternare cicli di congelamento e scongelamento.
- Digestione della parete con enzimi: Utilizzo di enzimi come lisozima (per la parete cellulare batterica), liticase, zimolase e chitinase.
- Solubilizzazione chimica: Utilizzo di solventi come acetone, detergenti e agenti caotropici.
- Sonicazione: Uso di ultrasuoni per rompere le cellule.
- French press: Far passare le cellule sotto pressione attraverso un capillare.
- Waring Blenders e Omogeneizzazione (Potter, frullatore): Utilizzo di lame per rompere le cellule.
Si prende un tessuto, lo si mette in sospensione per separare alcune cellule dal resto, poi si può operare per sonicazione e quindi sottoporre le cellule a onde sonore che le rompono; oppure si forzano le cellule tramite forellino sotto pressione che le rompe; oppure detergenti a bassa concentrazione per creare buchi nelle membrane perché i detergenti hanno componente lipidica che entra nella membrana creando fori. Il sonicatore utilizza ultrasuoni ad elevata potenza.
Solubilità Differenziale e Precipitazione
Le proteine fra loro possono avere diversa solubilità perché la solubilità dipende dalle forze che ci sono tra molecole di soluto e tra molecole di soluto e solvente. Si tratta di cambiare questo equilibrio e portare un soluto dall’interazione con un certo solvente o con un altro soluto a un altro solvente.
Riduzione di volume perché noi vogliamo tenerci la nostra proteina e non vogliamo le altre. Se a quest'altra soluzione aggiungiamo un altro solvente abbiamo che a precipitare è la nostra proteina. In questo modo troviamo pellett, cioè grumetto che si forma sul fondo del recipiente.
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Questo metodo spesso si realizza usando Sali, cioè ioni carichi. La forza ionica dipende dalla concentrazione molare delle specie ioniche e dalla carica dello ione.
Salting In e Salting Out
La solubilità delle proteine può essere influenzata dalla presenza di sali, come l'insolfato di potassio, l'ammoniosolfato e il solfato di magnesio. L'andamento della solubilità non è lineare, ma dipende dalla concentrazione dei sali.
A basse concentrazioni di sali si osserva un fenomeno chiamato "salting in", in cui la proteina diventa più solubile. Tuttavia, quando si supera una certa forza ionica, si verifica il fenomeno del "salting out", in cui la proteina esce dalla soluzione e precipita.
Centrifugazione
La centrifugazione si basa sull'uso della forza centrifuga per separare delle componenti. La provetta, se viene messa a roteare vorticosamente, assume una forma orizzontale. R(t) è la distanza della particella dal centro di rotazione e questa distanza cambia nel tempo: più ruota la provetta più il campione si sposterà verso il fondo della provetta. La forza centrifuga è la forza che agisce sulla particella e la porta a spostarla verso il fondo della provetta. G è il campo centrifugo o accelerazione di gravità.
Centrifugazione Differenziale
Nella centrifugazione differenziale si effettua la separazione in frazioni tramite centrifugazioni successive, aumentando gradualmente il campo centrifugato applicato. Se la centrifugazione dura a lungo, si ha una diversa disposizione sul fondo della provetta delle particelle: le particelle più grandi cadono sul fondo.
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Cromatografia
Quando si svolgono processi di purificazione per cromatografia si usano delle colonne cromatografiche. La colonna viene preparata con una resina, il campione viene preparato a parte per il caricamento in una siringa e verrà caricato del tampone sulla colonna che verrà quindi sottoposta a un certo flusso. Questo avviene grazie a macchinari che pompano liquido nella colonna. Le proteine verranno iniettate con campione, si legheranno o meno alla colonna e verranno poi diluite e analizzate con diversi metodi.
Componenti del Sistema Cromatografico
- Pompa peristaltica: Pompe che creano un movimento continuo di liquido in un tubo flessibile collegato alla colonna. Possono variare la velocità del flusso. Si trovano a monte della colonna, hanno due tubicini: uno che preleva il tampone dai flaconi e l'altro che porta il liquido verso la colonna. C'è una struttura triangolare rotante che preme sul tubicino di gomma e determina lo spostamento di porzioni di liquido al suo interno.
- Collettori di frazioni: A valle del sistema, dopo il detector. Hanno una struttura a revolver che deve ospitare provette dove cadono gocce che escono dalla colonna stessa. Permettono di raccogliere separatamente il flusso che esce dalla colonna. È la fase che ci permette di separare le proteine quando vengono raccolte e quindi andare incontro alla loro purificazione.
- Detector: È la fase che ci permette di vedere fisicamente il progredire di questo processo. Ci permette di identificare il campione che viene diluito dalla colonna. Il principio si basa sul fatto che le molecole biologiche sono così piccole da essere invisibili ad occhio nudo quindi noi sfruttiamo alcuni principi fisici per osservarle: la capacità che hanno di assorbire radiazioni nell'UV o nel visibile. I rilevatori più comuni sono piccoli spettrofotometri che emettono luce a una singola lambda (peresempio 280 nm). In questo modo quando la proteina attraversa il detector si ha un aumento di assorbanza e quindi avremo un segnale che indica l'uscita di una proteina.
Cromatogramma
La rivelazione avviene quando il detector raccoglie la fuoriuscita dei campioni goccia a goccia sul fondo della colonna e crea una figura chiamata cromatogramma. Sull'asse x è rappresentato il volume diluito dalla colonna o il numero di frazioni, mentre sull'asse y è presente l'assorbimento a 280 nm. I picchi sul grafico indicano che l'assorbanza a 280 nm aumenta man mano che le frazioni vengono riempite o che il volume passa attraverso la colonna stessa.
Separazione Magnetica
Presso il Dipartimento di Tecnologia della Technische Universität München, si stanno conducendo studi sull’impiego di separatori magnetici per la purificazione delle proteine sia nel settore farmaceutico che in quello alimentare. La TU München si è concentrata sull’evoluzione di una nuova procedura per la purificazione delle proteine, in grado di isolare prodotti di alta qualità con un elevato grado di purezza, partendo da grandi quantitativi. La procedura di purificazione delle proteine tramite separazione magnetica, considerata un’alternativa al filtraggio e alla cromatografia, è diventata il tema principale degli studi. In questo contesto, è stato preso in considerazione l’utilizzo di microparticelle monodisperse, noti come “granuli magnetici”, dotati di speciali molecole leganti.
Con la separazione magnetica, non è più necessaria una depurazione preliminare tramite filtraggio, e le nanoparticelle utilizzate presentano un costo inferiore rispetto ai prodotti specifici per la cromatografia. Inoltre, a differenza dei prodotti cromatografici, le nanoparticelle non sono porose, consentendo così un legame proteico senza perdita di resa.
Il segnale può inoltre essere utilizzato per individuare una fuoriuscita indesiderata di nanoparticelle nel prodotto, perché queste assorbono fortemente la luce. In questo caso è importante anche che la velocità del flusso non sia eccessivamente alta, per evitare la fuoriuscita delle particelle magnetiche legate dalla camera di separazione.
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Nel complesso, sono ancora necessari ulteriori lavori di ricerca per valutare l'uso su grande scala della separazione magnetica con nanoparticelle di ossido di ferro nell'industria farmaceutica e alimentare.