Le proteine, sintetizzate come catene polipeptidiche che si estendono in modo spazialmente non strutturato, devono raggiungere una conformazione tridimensionale stabile per poter svolgere le loro funzioni biologiche. Da decenni è noto che tutte le informazioni necessarie a un polipeptide denaturato per il raggiungimento di una conformazione stabile e funzionale sono contenute all'interno della sua stessa sequenza amminoacidica.
In teoria, quindi, la conformazione biologicamente attiva di una proteina dovrebbe essere desumibile una volta che sia nota la sua struttura primaria. In pratica, però, sono ancora ignote le regole che ci permetterebbero di predire la conformazione spaziale di una proteina a partire dalla conoscenza della sequenza lineare dei suoi amminoacidi.
Il Processo di Folding delle Proteine
L'insieme delle modifiche conformazionali che in una proteina caratterizzano i passaggi da una struttura lineare a una struttura tridimensionale è denominato 'folding' (ripiegamento). La comprensione dei meccanismi utilizzati dai polipeptidi per raggiungere una struttura tridimensionale che li renda in grado di svolgere correttamente le loro funzioni biologiche è stata in questi ultimi anni notevolmente favorita da numerosi studi sulla chimica fisica e sulla biologia cellulare di questo processo.
Sebbene la conoscenza di tale argomento sia lontana dall'essere completa, è, tuttavia, opinione generale che il folding proceda attraverso molteplici passaggi distinti. Durante questo processo biologico altamente complesso si devono infatti formare e rompere numerose interazioni all'interno della catena polipeptidica in fase di ripiegamento e, in vivo, tra essa e gli enzimi e le proteine che facilitano questo processo.
Idealmente lo stato privo di folding è il cosiddetto random coil (catena attorcigliata a caso), in cui le conformazioni possibili, anche per una proteina di piccole dimensioni, sono moltissime. In questa fase il polipeptide si dovrebbe trovare in uno stato in cui la sua catena è molto estesa nello spazio e le interazioni non covalenti, che normalmente stabilizzano lo stato nativo, sono inesistenti.
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È lecito supporre che le proteine, sintetizzate come polipeptidi lineari sui ribosomi, in vivo comincino il folding durante la loro stessa sintesi. Tuttavia evidenze sperimentali suggeriscono che le proteine destinate a essere veicolate a particolari compartimenti cellulari, quali cloroplasti, mitocondri e reticolo endoplasmatico, passino attraverso le membrane intracellulari in una conformazione estesa o con folding lasso.
Conformazioni Globulari Semisolide (Molten Globule)
È stato osservato che molte proteine, in certe condizioni, si trovano in una conformazione stabile che non è di folding compiuto, ma neanche di completa disorganizzazione sterica. Il verificarsi di conformazioni globulari semisolide (molten globule) è ben documentato. Le proprietà caratteristiche di tali strutture sono:
- La maggior compattezza rispetto allo stato di random coil e la dimensione lievemente maggiore rispetto alla proteina nativa.
- Un contenuto in strutture secondarie simile a quello della proteina con folding completo.
- La presenza di superfici idrofobiche esposte all'esterno, che le rendono suscettibili di aggregazione reciproca.
- Un'entalpia pressoché identica a quella che esse stesse hanno in uno stato privo di folding.
- Un'interconversione, dalla condizione di strutture globulari semisolide allo stato di completa disorganizzazione sterica, rapida e non cooperativa, e invece passaggio allo stato di folding completo lento e cooperativo.
Queste osservazioni suggeriscono che la struttura globulare semisolida sia una molecola collassata, dotata di strutture secondarie simili a quelle della corrispondente proteina nativa, ma priva di strutture terziarie stabili.
Lo Stato Nativo: Caratteristiche Generali
Lo stato nativo di molte proteine diverse è stato esaminato con la cristallografia a raggi X e con l'analisi spettroscopica NMR. Questi studi hanno chiarito alcuni aspetti generali delle proteine globulari il cui folding sia avvenuto compiutamente e che si trovano quindi nello stato nativo. La caratteristica che accomuna tutte queste proteine globulari è la non polarità delle catene laterali che formano la parte interna della struttura e la generale prevalenza di catene laterali idrofiliche esposte alla superficie.
Per la maggior parte delle proteine non si conosce che un unico stato di folding completo.
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Vie di Refolding
Si ritiene che il refolding in vitro avvenga attraverso diverse vie che coinvolgono uno o più stati intermedi di folding relativamente stabili. Questi ultimi sembrano trovarsi in un equilibrio rapido con lo stato di denaturazione completa (nell'ordine di millisecondi), mentre sono convertiti allo stato nativo solo molto lentamente.
Si ritiene che la conversione degli intermedi di folding nello stato nativo sia un processo cooperativo in cui il verificarsi di un'interazione rende stabile la successiva, che a sua volta stabilizzerà la prima interazione. La semplice via lineare di folding che procede attraverso la formazione di una serie di intermedi, uno successivo all'altro, potrebbe non essere applicabile alla maggior parte dei polipeptidi.
Esistono varie prove dell'esistenza di vie di folding multiple e indipendenti. Secondo questa ipotesi, il folding di una proteina denaturata potrebbe avvenire attraverso vie distinte e parallele che comportano l'insorgenza di forme intermedie diverse ma che portano a un unico stato nativo ben definito.
È sorto il dubbio che gli intermedi osservati non rappresentino stati reali del folding, ma che siano invece prodotti di reazioni collaterali non produttive che non conducono allo stato nativo. Gli esperimenti in vitro hanno sicuramente un valore significativo nel definire i tipi di interazioni intramolecolari che guidano il folding delle proteine, ma non riflettono accuratamente i processi di folding delle proteine nascenti all'interno della cellula.
Le proteine non completamente strutturate, o in stati intermedi di folding, tendono a esporre superfici idrofobiche all'ambiente acquoso circostante e sono quindi particolarmente inclini all'aggregazione. In vivo la temperatura fisiologica e l'alta concentrazione sia delle proteine totali sia dei polipeptidi non strutturati favoriranno di gran lunga le interazioni improduttive di aggregazione rispetto alla via di folding corretta.
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Un'ulteriore differenza tra il folding delle proteine in vitro e in vivo è il livello di complessità di molte proteine all'interno delle cellule. Proteine di membrana altamente idrofobiche, proteine che si assemblano in complessi enzimatici o in microfilamenti e proteine che sono modificate durante o dopo il processo di traduzione mediante legami con lipidi o carboidrati difficilmente seguiranno le vie di folding valide per piccole proteine globulari.
Un'ulteriore considerazione è che, nella cellula, le proteine sono sintetizzate per gradi sui ribosomi e, nel caso di proteine dirette all'interno degli organelli, sono traslocate attraverso le membrane in forma estesa; esse dovrebbero quindi, secondo la teoria del folding cooperativo, permanere in forma denaturata almeno fino al compimento della sintesi del primo dominio strutturale.
Ruolo degli Enzimi e dei Chaperon Molecolari
Inoltre si è visto che alcune tappe lente nel folding delle proteine sono catalizzate da enzimi specifici. Due passaggi cruciali per la cinetica del processo di folding in vitro, consistenti nell'isomerizzazione di legami covalenti, possono essere catalizzati da enzimi cellulari purificati. L'enzima proteindisolfuroisomerasi (PDI) catalizza lo scambio tiolo-disolfuro e promuove la formazione, l'isomerizzazione o la riduzione di ponti disolfuro all'interno delle proteine.
Gli enzimi peptidil prolil cis-trans isomerasi (PPIasi) catalizzano l'altrimenti lenta isomerizzazione dei legami peptidici che precedono i residui amminoacidici di prolina. La formazione non catalizzata di legami disolfuro è una tappa lenta nel processo di folding di molte proteine e PDI accelera questa reazione.
Poiché solo le proteine della via secretiva contengono legami disolfuro, PDI è localizzato essenzialmente in compartimenti cellulari che sono parte integrante di tale via. Grazie alla presenza di questo enzima, in vivo la formazione di legami disolfuro corretti può essere molto rapida. In alcuni casi, come per le catene peptidiche delle immunoglobuline, è addirittura un evento cotraduzionale, cioè avviene prima che la sintesi della catena polipeptidica sul ribosoma sia terminata: appena un intero dominio proteico viene traslocato nel lume del reticolo endoplasmatico, si forma contemporaneamente il singolo legame disolfuro interno a quel dominio.
Il ruolo di PDI appare ora abbastanza chiaro: esso non determina la via di folding ma piuttosto catalizza passaggi cineticamente lenti. I legami peptidici possono esistere sia in forma cis sia in forma trans. Generalmente, dal punto di vista energetico, la forma trans è 10.000 volte più stabile della forma cis.
La situazione è diversa per i legami peptidici tra un amminoacido qualunque e la prolina: in questo caso la forma trans è pur sempre favorita, ma solo di 4 volte. L'isomerizzazione cis-trans spontanea dei legami peptidici prolinici è lenta. L'isomerizzazione dei legami peptidici amminoacido-prolina non corretti è, perciò, uno di quei passaggi lenti cruciali nel determinare la cinetica di folding di una proteina nella cellula. La reazione può essere catalizzata da enzimi con attività tipo PPIasica.
Le PPIasi sono molto abbondanti, distribuite in modo quasi ubiquitario e sono presenti in tutti i compartimenti cellulari. Studi in vitro sulle PPIasi hanno mostrato che tali enzimi accelerano il refolding di un ampio spettro di proteine, ma con efficienza variabile. I legami prolinici situati all'interno degli intermedi di folding non sono tuttavia accessibili alle PPIasi.
La reazione di folding delle proteine che viene catalizzata da questi enzimi è una rotazione di 180° attorno all'asse C-N del legame peptidico che precede la prolina, che non coinvolge né scissione né formazione di legami covalenti. Perciò le PPIasi possono essere classificate come 'conformasi' (cioè enzimi in grado di modificare la conformazione molecolare) dotate di un'altissima efficienza.
Chaperon Molecolari: Facilitatori del Folding
Alcune famiglie di proteine, strutturalmente non correlate ma universalmente conservate, aiutano le proteine neosintetizzate ad assumere la loro conformazione nativa. Queste proteine, ora collettivamente denominate 'chaperon' molecolari, si legano ai polipeptidi quando si trovano nello stato totalmente o parzialmente denaturato, impedendone così l'aggregazione.
Le chaperon molecolari sono piuttosto abbondanti e l'espressione di molte di esse aumenta notevolmente in diverse condizioni di stress della cellula. Per ragioni storiche molte di queste chaperon molecolari sono classificate come 'proteine dello shock da calore' (Hsp, Heat shock proteins) o proteine da stress.
Nonostante il legame e il rilascio da alcune Hsp siano regolati dal legame e dall'idrolisi dell'ATP, le chaperon molecolari non possono essere considerate come catalizzatori del folding delle proteine. La maggioranza delle chaperon identificate finora appartiene a famiglie proteiche molto conservate.
Nonostante siano state identificate numerose classi di chaperon, ci occuperemo solo delle famiglie di chaperon Hsp60 (GroEL) e Hsp70 (DnaK), che sono quelle maggiormente studiate (i numeri indicano la massa molecolare approssimativa, in migliaia di dalton, dei membri di ciascuna famiglia). Negli ultimi anni è stato chiarito che queste principali chaperon intracellulari non agiscono da sole. Per assicurare la loro corretta ed efficiente funzione, si sono evolute le cosiddette co-chaperon. In alcuni casi queste co-chaperon partecipano direttamente all'azione delle chaperon, come DnaJ (Hsp40) di Escherichia coli, che agisce sinergicamente con DnaK.
Meccanismo di Azione dei Chaperon
In primo luogo bisogna distinguere tra 'facilitazione' di un processo e 'catalisi'. Durante il folding, i polipeptidi procedono attraverso stati generalmente separati solo da barriere energetiche molto basse. Proteine piccole, con un solo dominio, spesso assumono il folding corretto molto velocemente senza che nessun intermedio cinetico possa essere fissato.
Proteine più grandi iniziano la tappa finale del folding a partire da un intermedio che è separato dallo stato nativo da una barriera energetica molto alta. Il passaggio finale è quello che limita la velocità della reazione ed è fortemente cooperativo.
La velocità con cui appare il prodotto nativo dipenderà dalla concentrazione di questo intermedio e dalla costante di velocità. La costante di velocità è correlata alla barriera energetica che c'è tra l'intermedio e lo stato finale (energia di attivazione). La catalisi enzimatica, dovuta agli enzimi descritti prima, aumenta la costante di velocità abbassando questa barriera energetica.
Le chaperon molecolari, invece, facilitano il folding senza aumentarne la velocità. Esse aumentano la 'quantità' di proteina correttamente conformata. L'aggregazione, poiché comporta contatti tra due o più molecole, è ovviamente un processo almeno di secondo ordine e, quindi, la velocità di aggregazione è molto sensibile alla concentrazione degli intermedi di folding.
Il folding, invece, è un processo di primo ordine e, quindi, molto meno influenzato dalla concentrazione. Di conseguenza, un incremento della concentrazione degli intermedi di folding liberi porterà a un aumento dell'aggregazione, mentre una diminuzione della loro concentrazione favorirà il folding. Una chaperon potrebbe agire diminuendo la concentrazione degli intermedi liberi.
Se il legame alle chaperon deve efficientemente competere con l'aggregazione, la velocità di legame dovrebbe avvicinarsi al limite di incontro tra chaperon e polipeptide, ed è stato calcolato che questo accade. La chaperon potrebbe quindi efficacemente contrastare l'aggregazione. Caratteristica comune delle chaperon è la capacità di riconoscere polipeptidi solo allo stato non nativo.
La Famiglia delle Hsp70
Membri della famiglia delle Hsp70 si trovano in tutte le cellule procariotiche ed eucariotiche, nel citoplasma, nel nucleo, nel reticolo endoplasmatico, nei mitocondri e nei cloroplasti. Alcune proteine di questa grande famiglia sono essenziali per la crescita cellulare, altre sono copiosamente espresse in seguito a shock da calore, altre ancora, chiamate Hsc (Heat shock cognate) sono espresse, invece, in modo costitutivo. Tutti i membri della famiglia delle Hsp70 recano all'estremità amminoterminale un dom...
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