Gli enzimi sono catalizzatori biologici di natura proteica, senza i quali la vita non potrebbe esistere. Il nome degli enzimi deriva dal substrato o da una parola o una frase che ne descrive l'attività, aggiungendo il suffisso -asi. Per ovviare alle possibili ambiguità, il sistema internazionale di nomenclatura e classificazione degli enzimi prevede sei classi, a loro volta suddivise in sottoclassi.
In base a questo sistema ufficiale, ogni enzima è indicato da un nome sistematico che descrive la reazione catalizzata e da una serie di quattro numeri, il primo dei quali indica la classe, il secondo la sottoclasse. L'insieme di componente proteica e cofattori di un enzima è detto oloenzima.
Gli enzimi sono proteine prodotte nelle cellule vegetali e animali, che agiscono come catalizzatori accelerando le reazioni biologiche senza venire modificati. Gli enzimi operano combinandosi con una sostanza specifica per trasformarla in una sostanza diversa; esempi classici sono dati dagli enzimi digestivi presenti nella saliva, nello stomaco, nel pancreas e nell'intestino tenue, che esplicano una funzione essenziale nella digestione e contribuiscono a scindere gli alimenti nei costituenti di base, che possono quindi essere assorbiti e utilizzati dall'organismo, elaborati da altri enzimi o espulsi come rifiuti.
Ogni enzima ha un ruolo specifico: quello che scinde i grassi, per esempio, non agisce sulle proteine o sui carboidrati. Gli enzimi sono essenziali per il benessere dell'organismo. La carenza, anche di un singolo enzima, può provocare gravi disturbi.
Sito Attivo e Interazione con il Substrato
Il legame dei substrati avviene in tasche degli enzimi dette siti attivi, dove i residui amminoacidici presenti assicurano la specificità del legame con i substrati e i meccanismi di catalisi necessari a far avvenire la reazione. L'interazione tra il substrato e il sito attivo è stata classicamente descritta con il modello chiave-serratura, proposto da Fisher nel 1894. Secondo il modello chiave-serratura si realizza un incastro perfetto tra il substrato e il sito attivo.
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Il primo consiste nella riduzione dei movimenti casuali delle molecole reagenti che vengono immobilizzati sulla superficie dell'enzima per favorirne l'orientamento corretto ai fini della reazione. Secondariamente, l'interazione con l'enzima sottrae il substrato all'alone di solvatazione realizzato dalle molecole di acqua che, grazie ai legami a idrogeno, stabilizza gran parte delle molecole biologiche nelle cellule.
Energia di Attivazione e Velocità di Reazione
Nelle cellule, le biomolecole non reagiscono spontaneamente perché stabili e le reazioni a cui andrebbero incontro hanno un'energia di attivazione così alta da renderle quasi improbabili. Gli enzimi rendono possibili le reazioni in ambito biologico, facendole avvenire in un arco di tempo brevissimo, dell'ordine dei millisecondi, perché abbassano l'energia di attivazione. Il raggiungimento della velocità massima è dovuto alla saturazione dei siti attivi delle molecole degli enzimi.
Quando si parla di enzimi non è corretto parlare di reazioni di equilibrio, si parla, invece, di stato stazionario (stato in cui un certo metabolita si forma e si consuma continuamente, mantenendo la sua concentrazione pressoché costante nel tempo).
Costante di Michaelis-Menten
Nell'equazione di Michaelis-Menten figura la costante Km (costante di Michaelis), specifica per ogni reazione catalizzata. Attraverso la costante di Michaelis-Menten abbiamo un'indicazione dell'affinità tra enzima e substrato: se la KM è piccola c'è un'elevata affinità tra enzima e substrato, quindi l'addotto ES è stabile.
Regolazione Allosterica e Inibizione
La regolazione allosterica si basa sul cambiamento conformazionale dell'enzima: cambiamenti anche minimi nell'arrangiamento dei residui amminoacidici nella struttura tridimensionale della proteina possono influenzare notevolmente la velocità della reazione, aumentandola o diminuendola. I cambiamenti conformazionali sono indotti da piccole molecole, dette modulatori allosterici, che generalmente si legano in siti diversi dal sito attivo. Le sostanze che in modo specifico rallentano o bloccano una reazione sono dette inibitori. Molti farmaci sono inibitori di vie enzimatiche.
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Si parla di inibizione competitiva quando una molecola (inibitore) è in grado di competere con il substrato. Per similitudine strutturale, l'inibitore, può reagire al posto del substrato; ecco da cosa deriva la terminologia "inibizione competitiva". La costante di Michaelis Menten diminuisce all'aumentare della concentrazione di inibitore: apparentemente, quindi, l'affinità dell'enzima per il substrato aumenta.
Esempi Specifici di Enzimi e Loro Funzioni
Sono una famiglia di enzimi alla quale appartengono chimotripsina e tripsina. Il prodotto del gene che codifica per la chimotripsina non è attivo (si attiva con un comando); la forma non attiva della chimotripsina è rappresentata da una catena polipeptidica di 245 amminoacidi.
La chimotripsina è prodotta dalle cellule chimose del pancreas dove è contenuta in apposite membrane ed espulsa attraverso il dotto pancreatico nell'intestino, al momento della digestione del cibo: la chimotripsina è infatti un'enzima digestivo. Le proteine e le sostanze nutritive che ingeriamo attraverso la dieta, sono sottoposte alla digestione per essere ridotte a catene più piccole e per essere assorbite e trasformate in energia (es. Gli enzimi vengono prodotti in una forma non attiva e vengono attivati solo quando raggiungono la "sede in cui devono operare"; terminata la loro azione, vengono disattivate.
Una sottofamiglia delle serin proteasi è quella degli enzimi coinvolti nella coagulazione (che consiste nella trasformazione di proteina, dalla loro forma inattiva ad un'altra forma che è attiva). Tali enzimi fanno sì che la coagulazione sia il più efficace possibile e sia circoscritta nello spazio e nel tempo (la coagulazione deve avvenire velocemente e deve verificarsi solo in vicinanza della zona lesa).
Esistono enzimi modulatori (regolatori) ed enzimi inibitori per altri enzimi: interagendo con quest'ultimo ne regolano o ne inibiscono l'attività; anche il prodotto di un enzima può essere inibitore per l'enzima.
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Lisozima
Il lisozima è in grado di rompere la parete cellulare dei batteri. I batteri, e, in generale, gli organismi unicellulari, hanno bisogno di strutture meccanicamente resistenti che ne limitino la forma; all'interno dei batteri c'è una pressione osmotica molto alta perciò richiamano acqua. La parete cellulare è costituita da una catena polisaccaridica in cui si alternano molecole di N-acetil-glucosammina (NAG) e molecole di acido N-acetil-muramico (NAM); il legame tra NAG e NAM si rompe tramite idrolisi. Il gruppo carbossilico del NAM, nella parete cellulare, è impegnato in un legame peptidico con un amminoacido.
Il lisozima è un antibiotico (uccide i batteri): agisce facendo una crepa nella parete batterica; quando si rompe questa struttura (che è meccanicamente resistente) il batterio richiama acqua fino a scoppiare. Nella posizione tre del solco c'è una strozzatura: in tale posizione si può piazzare solo un NAG, perché il NAM, che è di dimensioni superiori, non riesce ad entrare. Il pH ottimale per il funzionamento del lisozima è cinque.
Galattosil-transferasi e α-lattalbumina
Durante la gravidanza, vengono sintetizzate le glicoproteine dalle cellule della ghiandola mammaria per azione della galatosil-tranferasi (ha un'omologia di sequenza del 40% con il lisozima): questo enzima è in grado di trasferire un gruppo galattosile da una struttura ad alta energia ad una struttura glicoproteica. Durante la gravidanza viene indotta l'espressione del gene che codifica per la galattosisil-transferasi (si ha l'espressione anche di altri geni che danno anche altri prodotti): si verifica un aumento delle dimensioni del seno perché viene attivata la ghiandola mammaria (precedentemente non attiva) la quale deve produrre il latte.
Durante il parto, viene prodotta l'α-lattalalbumina che è una proteina regolatrice: è in grado di regolare la capacità catalitica della galattosil-transferasi (per discriminazione del substrato).
Catabolismo degli Aminoacidi
Gli aminoacidi derivanti dalla digestione delle proteine di origine interna o alimentare possono essere deaminati ed il loro scheletro carbonioso puo' essere utilizzato per produrre energia. L'ammoniaca derivante dalla deaminazione degli aminoacidi e' tossica e non puo' essere usata per produrre energia; viene invece convertita in urea nel ciclo omonimo ed eliminata con le urine.
Nel caso degli aminoacidi diversi dall'acido glutamico il meccanismo piu' comune di deaminazione avviene in due passaggi: prima una amino transferasi specifica trasferisce il gruppo aminico dall'aminoacido in questione all'acido α - chetoglutarico (un metabolita del ciclo di Krebs); i prodotti di questa reazione sono il chetoacido corrispondente all'aminoacido e l'acido glutamico. Nel secondo passaggio l'acido glutamico prodotto viene deaminato dalla glutamico deidrogenasi.
In ogni caso, alla fine di questo processo i prodotti sono α - chetoacidi e ammoniaca.
Ciclo dell'Urea
Il ciclo dell'urea e' un percorso catabolico dissimilatorio, il cui fine non e' produrre energia ma utilizzare l'ammoniaca prodotta nel corso del metabolismo degli aminoacidi per sintetizzare l'urea, molecola che viene finalmente escreta nelle urine. Tutti gli animali assorbono con la dieta aminoacidi in eccesso rispetto al loro fabbisogno; questi vengono deaminati, trasformati in acetil-CoA ed avviati al ciclo di Krebs. L'ammoniaca derivante dalla deaminazione degli aminoacidi e' tossica e deve essere eliminata.
Il ciclo dell'urea inizia con la biosintesi del carbamil-fosfato a partire da ammoniaca e bicarbonato; la reazione, catalizzata dalla carbamilfosfato sintetasi consuma due molecole di ATP. L'enzima ornitina carbamil transferasi combina tra loro una molecola di ornitina e una di carbamilfosfato per sintetizzarne una di citrullina (reazione 1; ornitina e citrullina sono due aminoacidi non proteici). La argininsuccinato sintetasi utilizza citrullina e acido aspartico (un aminoacido proteico) per produrre acido argininosuccinico, con consumo di ATP (reazione 2).
L'arigininosuccinato liasi rompe l'acido argininosuccinico per produrre acido fumarico e arginina (altro aminoacido proteico; reazione 3); ed infine l'arginasi degrada l'arginina in ornitina ed urea. I due atomi di azoto della molecola di urea vengono uno dall'ammoniaca ed uno dall'acido aspartico.
Catabolismo dei Residui degli Aminoacidi
Il chetoacido che risulta dalla deaminazione dell'aminoacido puo' essere convertito in uno zucchero o suo derivato (aminoacidi "glicogenici" o in un acido grasso o suo derivato (aminoacidi "lipogenici"). La maggioranza degli aminoacidi e' glicogenica: ad esempio la deaminazione dell'alanina produce acido piruvico (cfr. glicolisi), quella dell'acido glutammico acido ossalacetico (cfr. ciclo di Krebs); quella dell'acido aspartico acido ossalacetico (cfr. ciclo di Krebs); etc.
Pochi aminoacidi sono lipogenici: ad es. leucina e lisina. In genere le vie cataboliche e le transaminazioni sono reversibili e quindi consentono non soltanto la degradazione ma anche la biosintesi degli aminoacidi, se necessaria all'organismo.
Di seguito una tabella riassuntiva del catabolismo degli aminoacidi:
| Aminoacido | Prodotto | Via Metabolica |
|---|---|---|
| Acido aspartico, Asparagina | Acido ossalacetico | Ciclo di Krebs |
| Acido glutamico, Glutamina | Acido alfa chetoglutarico | Ciclo di Krebs |
| Arginina, Prolina, Istidina | Acido glutamico -> alfa chetoglutarico | Ciclo di Krebs |
| Lisina | Acetil-CoA | Ciclo di Krebs |
| Leucina | Acetil-CoA | Ciclo di Krebs |
| Fenilalanina, Tirosina | Acetil-CoA | Ciclo di Krebs |
Studi Sulla Catalisi Enzimatica
Uno dei progressi fondamentali dell'età della biologia molecolare (1950-1970) è stato la descrizione, attraverso i processi chimici, del meccanismo della catalisi enzimatica. Parecchie migliaia di enzimi, che catalizzavano reazioni chimiche differenti, erano state isolate da piante, animali e microrganismi. L'intervallo dei pesi molecolari trovato per le proteine enzimatiche varia entro limiti piuttosto ampi, che vanno da un minimo di 103 a un massimo dell'ordine di 106 Dalton.
L. Michaelis, sulla base di studi propri e di altri, giunse a due importanti conclusioni sul comportamento delle reazioni enzimatiche: la prima, riguardante la velocità delle reazioni catalizzate da enzimi, a concentrazione di enzima costante, mostra una dipendenza dalla concentrazione di substrato del tutto caratteristica. Questi risultati sono stati interpretati ipotizzando la formazione di un complesso enzima-substrato come prima tappa della reazione catalitica. In condizioni di saturazione tutti i siti catalitici presenti in una soluzione sono occupati da molecole di substrato.
Un secondo punto posto in evidenza da Michaelis riguardava la dipendenza critica dal pH della velocità delle reazioni enzimatiche, che sembrava indicare l'importanza dello stato di protonazione dei gruppi ionizzabili nei residui di amminoacidi dell'enzima.
Tutti i principi fondamentali della cinetica degli stati stazionari sono stati stabiliti da J. B. S. Haldane (v., 1930). G. M. Briggs e J. B. S. Haldane dimostrarono come fosse possibile derivare espressioni per Km e V senza ricorrere alle ipotesi restrittive di un unico intermedio in equilibrio rapido. Se si misura la velocità iniziale v a una data concentrazione di substrato e se la quantità di substrato consumata durante la misura è trascurabile, si può affermare che la misura della velocità così fatta si riferisce ad una condizione di stato stazionario.
A partire dal 1912 furono condotti numerosi e approfonditi studi sull'influenza del pH sui parametri cinetici delle reazioni enzimatiche, ma i risultati furono usati a scopo descrittivo piuttosto che nell'intento di trovarne l'interpretazione attraverso opportuni meccanismi.
Struttura degli Enzimi e Siti Attivi
I primi enzimi a essere studiati in modo approfondito mediante tutte le possibili tecniche moderne furono - per ragioni di carattere pratico, come la facilità di reperirne notevoli quantità - quelli secreti dal pancreas (tripsina, chimotripsina, ribonucleasi). Questi enzimi hanno un peso molecolare relativamente basso (attorno a 20.000) e sono monomerici, si trovano, cioè, in soluzione sotto forma di una singola catena polipeptidica comprendente un certo numero di legami covalenti nella forma di ponti −S−S− che uniscono tra loro le due metà di un residuo di cistina.
La prima conclusione di carattere generale che si poté trarre dall'analisi delle sequenze fu che la sequenza degli amminoacidi di una proteina pura isolata da un animale di una data specie è unica. Paragonando tra di loro le sequenze di una stessa proteina enzimatica isolata da specie differenti si vide che nei diversi preparati vi erano alcune specifiche sostituzioni di residui di amminoacidi.
Dopo che diversi enzimi delle principali vie metaboliche furono purificati in quantità sufficienti per uno studio particolareggiato, si trovò che essi esistono in soluzione sotto forma di polimeri di catene polipeptidiche tra loro identiche. Le unità polipeptidiche sono tra loro legate da forze non covalenti (ponti salini, legami a idrogeno ed interazioni idrofobiche) e possono essere dissociate reversibilmente in unità individuali mediante vari reagenti. La forma di enzima polimerico che si trova più comunemente è il tetramero, dotato di quattro siti catalitici, ma si trovano anche dimeri, esameri e stati di aggregazione più complessi.
La conoscenza della struttura primaria di una proteina enzimatica costituisce un'informazione indispensabile per tutti gli studi successivi, ma non dà, di per se stessa, alcuna informazione su quali siano i residui di amminoacido che, trovandosi nelle vicinanze del sito attivo, risultano essenziali all'attività catalitica.
Uno dei più interessanti problemi chimici sulle reazioni del sito attivo riguarda l'effetto dell'ambiente sulla reattività dei gruppi. La molecola proteica, grazie alla complessa disposizione dei diversi residui di amminoacidi, ha la singolare capacità di inserire i propri gruppi in un dato intorno. Si sono potuti stabilire alcuni principi generali che regolano il modo in cui una catena polipeptidica si avvolge su se stessa assumendo una struttura tridimensionale.
Un interessante esempio di reattività selettiva può essere utilizzato per illustrare un ulteriore modo di affrontare lo studio chimico degli enzimi. La tripsina, la chimotripsina e diversi altri enzimi idrolitici vengono inattivati dal diisopropilliuorofosfato (DFP). Il risultato più significativo di questi esperimenti sta nella dimostrazione che, pur essendovi altri residui serinici nella molecola di queste proteine, soltanto uno di essi, ben specifico, reagisce col DFP e con reagenti analoghi.
Gli enzimi pancreatici sopra menzionati non possiedono gruppi −SH liberi; tutti i residui di cisteina sono ossidati formando ponti −S−S− intramolecolari. Tuttavia, molti enzimi possiedono un certo numero di gruppi −SH liberi, la cui reattività può assumere valori molto diversi, passando da situazioni in cui essi rappresentano i residui più reattivi dell'intera proteina, ad altre in cui, trovandosi mascherati all'interno della molecola, non sono accessibili ad alcun reagente.
Le informazioni che si sono potute ottenere, mediante questo tipo di indagine chimica, sulla natura del sito di legame del substrato sono di gran lunga più scarse di quelle ottenute sui residui implicati nel sito catalitico.
Analisi Strutturale con Raggi X
Il successo conseguito da M. F. Perutz e J. C. Kendrew nel chiarire la struttura tridimensionale dell'emoglobina e della mioglobina mediante l'analisi strutturale coi raggi X spinse molti studiosi ad applicare questo metodo allo studio degli enzimi. I primi enzimi presi in esame furono enzimi idrolitici monomerici relativamente piccoli, e i primi risultati significativi furono quelli ottenuti sul lisozima dell'uovo di gallina, un enzima che idrolizza i polisaccaridi a livello della membrana della cellula batterica.
Gli studi cristallografici fornirono la prova dell'esistenza di combinazioni enzima- substrato, prescindendo da ogni informazione di tipo chimico o cinetico, fatta eccezione per la conoscenza della maggior parte della struttura primaria.
Mentre per il lisozima ha importanza fondamentale la distorsione a livello del substrato, nel caso della carbossipeptidasi il confronto della struttura dell'enzima con quella dei complessi che forma con i suoi substrati indica notevoli alterazioni a livello della struttura proteica.
I risultati dell'analisi strutturale completa degli enzimi proteolitici chimotripsina e papaina confermarono i risultati chimici e cinetici sulla composizione del sito catalitico. In entrambi i casi, la conoscenza della struttura tridimensionale, che mette in luce le zone circostanti i gruppi essenziali all'attività catalitica, ha dato delle informazioni che devono essere prese in considerazione nella descrizione particolareggiata di un meccanismo di reazione.
Numero di Turnover degli Enzimi
Il numero di turnover degli enzimi, definito come il numero di moli di prodotto che si formano per mole di enzima al secondo, varia entro ampi limiti. Gli enzimi proteolitici idrolizzano il legame peptidico con velocità dell'ordine di 1 s-1 mentre l'enzima anidrasi carbonica catalizza la reazione CO2 + H2O → H2CO3 con velocità dell'ordine di 106 s-1. Un gran numero di enzimi importanti ha, tuttavia, numeri di turnover per sito attivo compresi tra 10 e 100 s-1.
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