La fibrosi cistica (FC) è una delle malattie genetiche letali più comuni nella popolazione caucasica. Viene trasmessa con modalità autosomica recessiva ed è causata da mutazioni nel gene CFTR, dalle quali dipende la produzione della corrispettiva forma alterata della proteina canale transmembrana del cloro.
I pazienti affetti da fibrosi cistica in Europa e nell’America settentrionale sono più di 70.000; in Italia viene diagnosticata in un neonato ogni 2.700, e si stima che i portatori sani siano circa 2 milioni e mezzo.
La fibrosi cistica si presenta come una malattia sistemica che ha effetti sulle ghiandole esocrine di polmoni, fegato, pancreas, e intestino, causando malattie croniche dell’apparato respiratorio, insufficienza pancreatica esocrina, disturbi dell’apparato gastro-intestinale.
Il Gene CFTR e le Mutazioni
Il locus della mutazione nel gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator gene) è stato localizzato nel 1989 sul braccio lungo del cromosoma 7; il gene è costituito da 250 kb di DNA genomico, contiene 27 esoni e produce un mRNA di 6,5 kb. Sequenziando il DNA di persone affette sono state individuati più di 750 alleli patogeni e più di mille diverse mutazioni. Può essere causata da più di 2000 mutazioni geniche diverse. Sono state descritte fino ad oggi più di 2.200 mutazioni e le conseguenze molecolari di tali mutazioni possono essere raggruppate in 7 classi.
Ad oggi sono state identificate oltre 2000 mutazioni differenti a livello del gene CFTR. La mutazione più frequente in tutte le popolazioni ed etnie è la F508del (ΔF508); in Italia la ΔF508 rappresenta il 51% delle mutazioni. Le mutazioni del gene CFTR interessano solitamente una o poche basi nucleotidiche e sono distribuite principalmente negli esoni o nelle sequenze di giunzione tra esoni ed introni.
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Le mutazioni nel gene CFTR possono essere raggruppate in 6 classi, in base ai meccanismi biomolecolari responsabili del deficit funzionale della proteina:
- Classe I: mutazioni che determinano l’assenza della proteina CFTR funzionante.
- Classe II: mutazioni che alterano il processamento della proteina.
- Classe III: mutazioni che provocano un deficit nell’attivazione del canale, nella sua funzione di “gating”. Le mutazioni colpiscono i siti di legame dell’ATP.
- Classe IV: mutazioni che determinano un difetto della permeabilità ionica.
- Classe V: proteina normalmente funzionante ma in scarsa quantità.
- Classe VI: instabilità della proteina sintetizzata.
- VII categoria: raggruppa le mutazioni che bloccano la produzione dell'RNA messaggero (mRNA), la molecola che trasporta il messaggio contenuto nel gene CFTR fino a minuscole "fabbriche" di proteine, i ribosomi.
Nella popolazione caucasica la mutazione più frequente del gene CTFR consiste nella delezione dell’amminoacido fenilalanina, presente nella posizione 508 della proteina normale. Questa mutazione è chiamata ΔF508 ed è responsabile della maggior parte dei casi di fibrosi cistica; a seconda della regione geografica, circa il 50÷70% degli individui affetti sono omozigoti.
Finora sono state identificate più di un migliaio di altre mutazioni nel gene CFTR, la cui frequenza relativa è molto variabile in relazione all’area geografica.
Le mutazioni nel gene CFTR sono catalogate in cinque classi, in base al meccanismo con cui alterano la funzione della proteina.
- Le mutazioni di classe I portano alla interruzione prematura della trascrizione, che ha come risultato un trascritto CFTR troncato e instabile, oppure un’espressione del tutto assente di CFTR.
- Le mutazioni missense (classe II) danno origine a un codone che specifica un amminoacido diverso da quello originario, o deleto, come nella mutazione (ΔF508). Queste mutazioni causano un avvolgimento errato della proteina che porta al trattenimento della proteina stessa nel reticolo endoplasmatico, e alla sua prematura degradazione.
In generale i pazienti con combinazioni nei due alleli delle varianti patogenetiche di classe I, II e III, che determinano la perdita della funzionalità della proteina CFTR, manifestano per lo più un fenotipo severo della malattia, con caratteristiche cliniche che comprendono:
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- insufficienza pancreatica,
- ileo da meconio alla nascita,
- malassorbimento e difetto di crescita,
- broncopneumopatia e compromissione della funzionalità respiratoria con andamento peggiorativo nel tempo,
- malattia epatica.
Le mutazioni appartenenti alle classi IV, V e VI sono in genere associate a un quadro clinico di fibrosi cistica più lieve con sufficienza pancreatica, compromissione polmonare più modesta e migliori aspettative di vita.
Le varianti patogenetiche di classe IV, V e VI sono fenotipicamente dominanti quando associate a varianti patogenetiche di classe I, II e III. Tuttavia, sia la variabilità genetica sia quella ambientale, nonché le terapie, rendono la correlazione genotipo - fenotipo complicata e spesso difficilmente prevedibile. Pertanto, la previsione del decorso della malattia a partire dal genotipo non è una prassi raccomandata. Spesso, infatti, pazienti con il medesimo genotipo possono presentare manifestazioni cliniche differenti, soprattutto per quanto concerne la compromissione polmonare.
La presenza di varianti in cis del gene CFTR o di varianti in altri geni definiti come “geni modificatori”, di cui ancora non è definito il ruolo funzionale, potrebbe spiegare parte di queste discrepanze. Tali variazioni di sequenza sono state infatti associate, in alcuni casi, ad una più frequente insorgenza di specifiche manifestazioni cliniche.
E’ importante sottolineare che non esiste al momento una chiara correlazione genotipo-fenotipo, poiché nella manifestazione della fibrosi cistica concorrono anche i cosiddetti geni modificatori e i fattori epigenetici.
Struttura e Funzione della Proteina CFTR
Il gene CFTR codifica una proteina costituita da 1.480 amminoacidi, localizzata nella membrana apicale delle cellule degli epiteli. La proteina CFTR è un canale transmembrana del cloro, attivato dalla proteina chinasi A mediante AMP ciclico, con la funzione di regolare gli scambi elettrolitici tra l’interno e l’esterno delle cellule di molte ghiandole dell’organismo. La sua alterazione causa anomalie del trasporto di ioni cloro attraverso le membrane cellulari e, in generale, della produzione delle secrezioni esocrine dell’organismo, che risultano dense e viscose, causando un danno progressivo degli organi coinvolti.
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CFTR è un membro della superfamiglia di proteine del trasporto ABC (ATP-Binding Cassette). Queste proteine sono regolate dall’AMP ciclico, e hanno in comune la funzione di trasporto di soluti, dagli ioni organici ai carboidrati, attraverso la membrana cellulare. Le mutazioni nei geni ABC sono associate a molte malattie genetiche, tra cui la sindrome di Dubin-Johnson e la degenerazione della macula.
Strutturalmente la proteina CFTR è un canale ionico formato da quattro domini disposti in due metà simmetriche, ciascuna comprendente un dominio transmembrana (MSD1 e MSD2) composto di sei segmenti, e un dominio NBD (Nucleotide Binding Domain) citoplasmatico, con proprietà di idrolisi dell’ATP. Ogni dominio MSD è connesso a un dominio citoplasmatico legante nucleotidi come ATP, chiamato Nucleotide Binding Domain (NBD).
Le due metà della proteina sono collegate da un dominio regolativo che, in accordo con i domini NBD, modula l’apertura del canale del cloro. Quando l’ATP è legato ai due domini NBD, il canale è aperto. L’idrolisi di una delle due molecole di ATP distrugge l’interazione NBD1-NBD2 e chiude il canale del cloro, interrompendo il flusso degli ioni.
Il canale CFTR si colloca sulla membrana cellulare di alcune ghiandole (salivari, pancreatiche e sudoripare), dei vasi deferenti, dell’intestino, delle vie respiratorie e delle vie biliari.
Ad esclusione delle ghiandole sudoripare, se il canale è assente o mal funzionante, le cellule epiteliali secernono meno ioni Cl- e riassorbono Na+ in eccesso, determinando di conseguenza una riduzione di acqua.
La conseguenza del difetto del canale CFTR è la produzione di secrezioni più asciutte, disidratate, dense e viscose.
Nelle vie aeree, il muco più viscoso tende ad accumularsi lungo la parete bronchiale e la clearance mucociliare diventa inefficace, favorendo l’instaurarsi di infezione broncopolmonare e la tendenza al ripetersi di infezioni polmonari.
Nelle ghiandole sudoripare, il difetto del canale CFTR comporta invece un’incapacità della ghiandola a recuperare attraverso il suo dotto escretore il cloro e il sodio, che vengono prodotti all’origine in concentrazione uguale a quella del plasma. Ne consegue una secrezione di sudore ad alto contenuto di elettroliti e notoriamente “salato”.
Il difetto della proteina CFTR non è uguale in tutti i malati affetti da fibrosi cistica. Può variare dalla totale mancanza della proteina stessa (difetto più grave), alla incompleta maturazione del canale o al funzionamento ridotto.
Diagnosi di Fibrosi Cistica
La diagnosi di FC si basa sulla presenza di uno o più manifestazioni tipiche della malattia e sulla evidenza oggettiva di disfunzione della proteina CFTR (indicata dalla positività del test del sudore), oppure dalla presenza di due mutazioni del gene CFTR che causano la malattia.
La diagnosi precoce assicura un pronto inizio del trattamento e questo è stato il principale razionale per i programmi di screening neonatale che sono stati implementati in molti paesi. La maggior parte di questi programmi si basa sul dosaggio dei livelli di tripsina nel sangue che sono elevati nei soggetti con FC; la diagnosi viene confermata dal test genetico per la ricerca delle più comuni mutazioni del gene CFTR sullo stesso campione di sangue raccolto per lo screening.
Talvolta la diagnosi non è chiara e le attuali linee guida suggeriscono di seguire regolarmente i bambini con diagnosi non conclusiva in quanto in circa il 20% dei casi col tempo emergeranno i criteri diagnostici per FC.
Il test del sudore è raccomandato per confermare la diagnosi sia nei bambini positivi allo screening, sia nelle persone con sintomi suggestivi. Il riscontro di concentrazioni di cloro nel sudore superiori a 60 mmoli per litro sono diagnostici per FC, ma un valore al di sotto di questa soglia diagnostica non necessariamente esclude la diagnosi.
Trattamento e Terapie Innovative
La cura per i pazienti con FC è andata incontro a una progressiva e profonda trasformazione, e la malattia costituisce un esempio di come la comprensione delle conseguenze funzionali di una malattia genetica possa portare a un miglioramento della prognosi nelle persone affette.
Progressi significativi sono stati ottenuti già nelle decadi passate implementando un modello di cura multidisciplinare in centri specialistici (in Italia i Centri Regionali di Riferimento per la Fibrosi Cistica) e utilizzando trattamenti di efficacia provata in trial clinici controlati, con grande attenzione allo stato nutrizionale, alla fisioterapia respiratoria e alla terapia antibiotica per la malattia polmonare.
Il miglioramento della prognosi verificatosi nelle ultime decadi ha cambiato la epidemiologia della FC e oggi una crescente popolazione di pazienti hanno raggiunto l’età adulta (in Italia in percentuale pari al 63,5% di tutti i pazienti).
Dal punto di vista terapeutico, sono stati fatti progressi sostanziali dapprima tramite l’implementazione di terapie “sintomatiche” allo scopo di contenere le manifestazioni della malattia come l’accumulo di muco e le infezioni croniche delle vie aeree.
Più recentemente, sono stati sviluppati nuovi farmaci, i modulatori della proteina CFTR, che invece mirano a correggere il difetto di base, ripristinando almeno in parte la funzione della proteina CFTR. Sono in corso anche studi sulla possibile modifica a trattamenti finora utilizzati, consentendo di sospenderne alcuni senza causare danno.
Per quanto riguarda la terapia rivolta al controllo o alla prevenzione dei sintomi, a parte il trattamento nutrizionale con una dieta ipercalorica ad elevato contenuto di grassi e la supplementazione con enzimi pancreatici, la maggior parte delle terapie precedentemente raccomandate erano focalizzate al trattamento e alla prevenzione dei sintomi respiratori.
La malattia polmonare in FC si manifesta con ritenzione cronica di muco, infezione e infiammazione delle vie aeree ed eventi respiratori acuti. Il peggioramento intermittente dei sintomi con tosse produttiva è in genere indicativo di una esacerbazione polmonare.
Le terapie che si propongono di migliorare la clearance del muco sono importanti componenti della terapia di mantenimento. La fisioterapia respiratoria con tecniche di clearance delle vie respiratorie attive o passive è utilizzata da tempo e considerata parte dello standard di cura.
Il farmaco mucolitico dornase alfa somministrato per via inalatoria è stato dimostrato migliorare la funzione respiratoria e ridurre la frequenza delle esacerbazioni polmonari. Il dornase alfa riduce la viscosità delle secrezioni nelle vie aeree rompendo i filamenti di DNA che derivano principalmente dai neutrofili presenti nelle vie respiratorie come risposta infiammatoria.
Anche la nebulizzazione o inalazione della soluzione ipertonica salina migliora la disidratazione delle secrezioni delle vie aeree e la clearance mucociliare.
Per quanto riguarda le infezioni acute croniche delle vie respiratorie queste sono causate da una varietà di patogeni tra i quali Stafilococco aureo e Pseudomonas aeruginosa, ma possono essere coinvolti altri germi Gram negativi, tra cui Burkholderia cepacia Complex, Alkaligenes xilosoxidans e anche Mycobatteri atipici.
Gli antibiotici svolgono un ruolo chiave nella terapia dei pazienti FC e vegono utilizzati per eradicare le prime infezioni soprattutto da pseudomonas, sia sintomatiche che asintomatiche, e ritardare così l’insorgenza dell’infezione cronica non più eradicabile. Sono poi utilizzati come terapia di mantenimento per via inalatoria nelle infezioni croniche e, infine, per il trattamento delle esacerbazioni polmonari, per via orale o endovenosa e con intensificazione della fisioterapia.
I funghi come l’aspergillo Fumigatus si trovano nelle secrezioni respiratorie dei pazienti FC e sono associati a un’aumentata frequenza di riacutizzazione respiratorie, tuttavia il trattamento con agenti antifungini rimane controverso.
Si tratta di un gruppo di farmaci, da somministrare per bocca, che vengono prescritti in relazione al tipo di mutazioni (genotipo) di cui il paziente è portatore. Il primo ad essere testato, Ivacaftor, è un potenziatore in grado di aprire il canale CFTR in pazienti con mutazioni associate a presenza della proteina in membrana, che tuttavia ha una ridotta funzione (conduttanza) in quanto il canale non si apre. I benefici della terapia con Ivacaftor documentati dai trial clinici sono stati straordinari, con marcato miglioramento della funzione polmonare, riduzione dei sintomi e delle riacutizzazioni respiratorie, e miglioramento dello stato nutrizionale.
In pazienti portatori della mutazione più comune (deltaF508) è invece necessario associare al potenziatore Ivacaftor un correttore, che appunto è un farmaco in grado di correggere il ripiegamento anomalo della proteina, permettendone il trasporto alla membrana cellulare. I primi farmaci correttori che sono stati sviluppati (Lumacaftor, Tezacaftor) hanno dimostrato effetti benefici modesti, ma è stata successivamente sviluppata una nuova generazione di correttori e la prima triplice combinazione di Elexacaftor, con Ivacaftor e Tezacaftor, ha dimostrato essere molto efficace in una percentuale ben superiore (attualmente circa l’80%) di pazienti portatori di almeno una mutazione F508del.
Va considerato che le persone con FC e malattia polmonare severa sono state escluse dalla maggior parte dei trial clinici con modulatori, ma la maggior parte dei pazienti che erano in lista di attesa per il trapianto sono stati rimossi dalla lista quando il trattamento stato iniziato una volta divenuto disponibile.
Infine, molte altre mutazioni sono state dimostrate essere responsive alla triplice terapia in vitro (in colture cellulari), per cui l’indicazione alla terapia negli Stati Uniti si è allargata. La valutazione della possibile risposta alla terapia può essere effettuata addirittura su cellule prelevate dal paziente (cellule epiteliali nasali o intestinali), soprattutto in soggetti portatori di mutazioni rare.
Rimane il problema dei pazienti a cui i modulatori attualmente disponibili non possono essere prescritti. L’impegno a sviluppare in tempi rapidi terapie efficaci per questi pazienti è massimo e numerosi trials di terapia genetiche sono attualmente in corso.
L’evoluzione della fibrosi cistica, e di conseguenza la durata e la qualità della vita, dipende da una combinazione di fattori. Questi sono in parte genetici, come le mutazioni del gene CFTR e l’influenza dei geni modificatori, ma anche legati a elementi di diversa natura.
Tra i fattori non genetici si annoverano le cure praticate e il livello di aderenza terapeutica da parte del paziente, l’ambiente di vita, che comprende famiglia, scuola, attività ricreative, sport, lavoro, socializzazione e condizioni climatiche, lo stile di vita adottato dalla persona, inclusa l’attività fisica, la dieta e l’attenzione alla salute generale.
La grande variabilità nella combinazione di questi fattori rende ogni malato unico.
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