L'osservazione delle proteine al microscopio ha subito un'evoluzione significativa grazie ai progressi tecnologici e allo sviluppo di sonde specifiche. Questo articolo esplora la matrice organica dell'osso, i sali inorganici, le tecniche di visualizzazione e le proteine fluorescenti, offrendo una panoramica completa di questo affascinante campo.
Matrice Organica dell'Osso
La matrice organica dell’osso è rappresentata da fibre collagene (con la caratteristica periodicità assile di 68-70 nm al microscopio elettronico) incluse in una sostanza amorfa costituita da proteoglicani e da glicoproteine. Dal punto di vista qualitativo è simile a quella del tessuto cartilagineo, ma le differenze si notano dal punto di vista quantitativo: la concentrazione di proteoglicani (con catene laterali costituite da condroitin solfato e cheratan solfato) è molto bassa (0,2-1% rispetto alla cartilagine in cui è del 35-40%) di modo che il collagene (di tipo I) diventa prevalente rispetto agli altri costituenti.
Per questo motivo la matrice ossea è acidofila ed Alcian blu-negativa mentre quella cartilagine è fortemente basofila, metacromatica ed Alcian blu-positiva. L’osso si colora inoltre con la reazione PAS per i polisaccaridi, per il suo contenuto in glicoproteine. Con la miscela ematossilina-eosina l’osso si colora in rosso mentre la cartilagine rimane incolore.
La matrice organica dell'osso contiene, oltre al collagene di tipo I (ne rappresenta il 90%), anche varie classi di macromolecole.
- Proteoglicani: Composti da glicosaminoglicani acidi, solitamente solforati, uniti assieme da brevi catene proteiche.
- Glicoproteine: Di solito fosforilate o solfatate, includono molecole diverse alcune delle quali sono ritenute giocare un ruolo fondamentale nel controllo dei processi di mineralizzazione.
Proteoglicani
Quelli meglio conosciuti sono:
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- Proteoglicano di tipo I (PG-I): Detto anche biglicano in quanto costituito da due molecole di condroitinsolfato unite ad una estremità da un polipeptide ricco di leucina; lo si ritrova sia nella sostanza intercellulare mineralizzata che in quella non mineralizzata adiacente alle cellule ossee e ai loro prolungamenti, il cosiddetto tessuto osteoide.
- Proteoglicano di tipo II (PG-II): Detto anche decorina in quanto tende ad associarsi alle microfibrille collagene come a decorarle. È formato da una parte proteica analoga a quella del PG-I unita ad una sola molecola di condroitinsolfato. Lo si ritrova nella sostanza intercellulare mineralizzata ma non nel tessuto osteoide, per cui si ipotizza che abbia un ruolo nell’orientare la deposizione dei cristalli minerali lungo le micro fibrille collagene.
Glicoproteine
Tra queste si annoverano:
- Osteonectina: La glicoproteina più abbondante (costituisce il 3% della matrice organica). È dotata di alta affinità per il calcio, sia come ione libero che associato in complessi di tipo cristallino. Si ritiene che essa agisca come elemento di nucleazione dei cristalli minerali, in quanto ritenuta capace di concentrare il calcio nelle sue adiacenze creando così le condizioni per avviare la precipitazione del fosfato di calcio. Si lega al collagene e all’idrossiapatite
- Fosfatasi alcalina: Un enzima capace di idrolizzare gruppi fosfato legati a substrati organici (come il piridossal-5-fosfato) attivo in ambiente alcalino (pH 8-10). Essa potrebbe giocare un ruolo nei processi di mineralizzazione, mettendo a disposizione gli ioni fosfato per la formazione dei cristalli minerali, oppure sarebbe invece coinvolta nella sintesi della matrice organica dell’osso.
- Fibronectina: Molecola di adesione localizzata prevalentemente nella matrice pericellulare e caratterizzata da una porzione capace di legarsi al collagene. Si ritiene che la fibronectina sia coinvolta nei processi di migrazione, adesione alla matrice e organizzazione delle cellule dell’osso.
- Sialoproteine, o BSP (bone sialo-proteins): Sono glicoproteine peculiari contenenti residui glicidici di acido sialico. Queste proteine posseggono una sequenza aminoacidica particolare Arg-Gly-Asp (sequenza RGD) che media l’adesione al substrato di svariati tipi cellulari, incluse le cellule dell’osso. Si ritiene pertanto che le sialoproteine ossee abbiano la funzione fisiologica di consentire l’adesione delle cellule alla matrice ossea. Se ne conoscono più tipi: osteopontina (o BSP-I), la BSP-II e la glicoproteina acida dell’osso (o BAG-75).
- Proteine contenenti l’acido g-carbossiglutammico (GLA): Un aminoacido particolare derivato dall’acido glutammico con un ulteriore gruppo carbossilico legato al carbonio in posizione g. Il GLA incluso in una proteina possiede, nella porzione del residuo, due gruppi carbossilici liberi e ravvicinati che a pH fisiologico sono ionizzati e carichi negativamente, e pertanto capaci di agire come una sorta di chelanti per i cationi bivalenti quali lo ione calcio.
Le proteine dell’osso contenenti il GLA sono di due tipi:
- Osteocalcina: (presenta un’elevata affinità di legame per l’idrossiapatite), o proteina GLA dell’osso, una piccola proteina contenente 3-5 residui di GLA. È stato ipotizzato che essa possa giocare un ruolo di inibizione della mineralizzazione in quanto ritenuta capace di legarsi allo ione calcio e di renderlo indisponibile per la combinazione con lo ione fosfato, inibendo così l’accrescimento dimensionale dei cristalli minerali.
- Proteina GLA della matrice: È presente sia nell’osso maturo che in quello in via di formazione, nonché nella cartilagine destinata a essere sostituita da tessuto osseo, come la cartilagine di accrescimento. Il suo ruolo biologico non è chiarito.
Sali Inorganici e Preparazione dei Campioni
La distribuzione delle fibre collagene e delle cellule ossee può essere studiata solo nei preparati decalcificati, cioè privati dei Sali inorganici. Ciò può essere ottenuto trattando l’osso con un acido debole o con un agente chelante, come l’acido etilendiaminotetracetico (EDTA).
Nei preparati non decalcificati le fibre collagene sono mascherate dall’abbondante matrice minerale che ha lo stesso indice di rifrazione ed appaiono come una massa omogenea acidofila. I sali inorganici sono disposti ordinatamente tra i fascetti di fibre collagene, attorno alle singole fibrille ed anche all’interno delle fibrille tra le microfibrille.
Dopo asportazione dei Sali di calcio si può rilevare che i fasci di fibrille sono disposti in maniera ordinata parallelamente tra loro in ciascuna lamella.
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Struttura dell'Osteone
I fasci collageni decorrono ad elica rispetto all’asse dell’osteone in ciascuna lamella, ma il passo dell’elica (cioè l’osteone) e la direzione delle fibre variano secondo angoli molto diversi nelle lamelle contigue. La direzione e l’inclinazione delle fibre sono invece grossolanamente regolari e costanti nell’ambito di una singola lamella.
In conclusione, nell’osteone si alternano lamelle le cui fibre hanno un andamento destrorso ed una particolare inclinazione e lamelle aventi fibre con direzione sinistrorsa ed inclinazione diversa. Questo comportamento è la ragione del fatto che nelle sezioni trasversali dei sistemi di Havers si alternano spesso lamelle striate e lamelle punteggiate.
Nelle prime le fibre decorrono più o meno parallelamente al piano della sezione e sono tagliate longitudinalmente; nelle lamelle punteggiate le fibrille sono disposte perpendicolarmente od obliquamente al piano della sezione e sono sezionate trasversalmente al loro asse maggiore.
Siccome le fibrille collagene sono birifrangenti, se sezioni trasversali di osteoni sono osservate con il microscopio a luce polarizzata, si osservano lamelle luminose (con fibre decorrenti sul piano di sezione) alternate a lamelle oscure (con fibre colpite perpendicolarmente al loro asse maggiore). L’alternanza di strie luminose ed oscure è interrotta da una croce oscura che corrisponde ai settori nei quali le fibre decorrono parallelamente alla direzione di vibrazione del nicol.
Oltre le fibre lamellari, negli strati esterni dell’osso si osservano i grossi fasci di fibre perforanti di Sharpey provenienti dal periostio.
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La Laminina: Una Glicoproteina Adesiva
La laminina è una glicoproteina adesiva molto voluminosa, componente più abbondante di tutte le lamine basali. Le glicoproteine adesive sono grosse molecole che presentano diversi domini dei quali almeno uno interagisce con proteine della superficie cellulare, le integrine, un altro con le fibre collagene e un altro con i proteoglicani, garantendo così alla cellula la possibilità di aderire sulla matrice extracellulare.
La laminina è composta da tre grosse catene polipeptidiche A, B1 e B2; le catene B si avvolgono attorno alla catena A, formando una struttura a forma di croce con un braccio lungo e tre braccia corte. Tutte e tre le catene sono legate da ponti disolfuro e per ciascuna di esse sono state trovate diverse isoforme, leggermente differenti.
Le laminine sono lunghe quanto lo spessore della lamina basale. La laminina è localizzata quasi esclusivamente nelle membrane basali e possiede siti di interazione per l’eparan solfato, il collagene IV, l’entactina e per la superficie cellulare.
Inoltre, in vitro, le molecole di laminina, mediante interazioni tra le estremità dei bracci della croce, si assemblano tra loro formando una trama simile al feltro. La laminina e le altre componenti della lamina basale hanno un ruolo decisivo durante lo sviluppo embrionale.
Infatti, durante gli stadi embrionali a quattro e otto cellule, la laminina, insieme alle altre componenti, contribuisce all’adesione delle cellule in una struttura sferica. Inoltre, durante lo sviluppo del sistema nervoso, i neuroni migrano lungo i percorsi formati dalla matrice extracellulare, contenenti anche laminina.
Microscopia Crioelettronica
La microscopia crioelettronica (crio-EM) è una tecnica che permette di studiare le proteine in un ambiente molto simile a quello fisiologico, senza alterazioni di struttura né di orientamento nello spazio. Le proteine in soluzione vengono applicate a un supporto, chiamato griglia, che viene immediatamente congelato in etano liquido a una temperatura di -180 °C.
Il processo di congelamento è così rapido che l’acqua forma direttamente un solido amorfo trasparente senza passare attraverso gli stadi cristallini: i cristalli d’acqua, infatti, hanno un contrasto maggiore e interferirebbero con l’acquisizione dell’immagine.
Una volta vetrificato, il campione viene caricato sul microscopio a trasmissione elettronica, precedentemente raffreddato a circa -190 °C; man mano che gli elettroni attraversano le proteine si creano delle proiezioni che vengono registrate da una fotocamera digitale.
Grazie a specifici algoritmi, le particelle vengono prima isolate e poi allineate una a una per selezionare quelle con la stessa disposizione nello spazio; le immagini “simili” vengono sommate a formare le cosiddette class averages, indispensabili per aumentare il contrasto della proteina che si trova in quella determinata posizione.
Indicatori Fluorescenti e Proteine Ricombinanti
La microscopia a fluorescenza ha registrato negli ultimi anni un marcato impulso, beneficiando del progresso tecnologico degli strumenti di indagine e dello sviluppo di sonde specifiche per marcare e seguire dinamicamente strutture cellulari o parametri fisiologici.
Gli indicatori fluorescenti dello ione Ca²+, che hanno esteso la determinazione di questo ione a tutti i tipi cellulari in coltura e in situ, e le proteine ricombinanti, che offrono il grande vantaggio di poter essere indirizzate selettivamente a distretti cellulari di interesse, tramite l'aggiunta di segnali di localizzazione specifici alla sequenza della proteina.
Indicatori Fluorescenti di Ca²+
Gli indicatori fluorescenti di Ca²+, il cui precursore è stata la molecola quin-2, ma che attualmente annoverano decine di composti diversi, hanno come punto di partenza un chelante selettivo per Ca²+, come l'EGTA o il BAPTA.
Per risolvere il problema dell'attraversamento della membrana cellulare, la molecola attiva è stata ulteriormente modificata da Tsien e collaboratori, esterificando (e quindi neutralizzando) i gruppi carichi. In questa forma la molecola, incapace di legare Ca²+, attraversa la membrana plasmatica delle cellule e raggiunge il citoplasma, dove enzimi che fanno parte del corredo normale della cellula (le esterasi) idrolizzano l'estere e ripristinano la forma attiva della molecola.
Proteine Luminescenti e Fluorescenti
Due tipi di sonde proteiche attualmente utilizzate derivano dall' ampia varietà di organismi bioluminescenti presenti in natura. La prima è data dalle proteine luminescenti, ossia proteine che emettono luce, spesso in risposta a variazioni di parametri di interesse fisiologico, quali le concentrazioni di ATP o di Ca²+.
Il secondo gruppo di sonde proteiche, che incontra una utilizzazione sempre più ampia, è dato dalle proteine fluorescenti. Tra queste, protagonista indiscussa è la green fluorescent protein di Aequorea victoria.
L'isolamento del cDNA dell'equorina (Inouye et al., 1985), ha di nuovo valorizzato questa proteina come strumento per misurare la concentrazione dello ione Ca²+ in cellule vive. Transfettare le cellule, ossia introdurre un plasmide che le induca a produrre una proteina estranea, quale l'equorina, è una procedura semplice ed efficace.
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