L'esperienza propone lo svolgimento di una reazione chimica finalizzata al riconoscimento delle proteine. Il saggio delle proteine con biureto è una tecnica ampiamente utilizzata in biochimica per la determinazione qualitativa e quantitativa delle proteine in una soluzione. Questo metodo si basa su una reazione chimica specifica tra le proteine e il reagente di biureto, che produce un cambiamento di colore facilmente misurabile.
Le proteine sono le sostanze organiche azotate costituenti fondamentali della materia vivente. Costituiscono enzimi, ormoni, anticorpi (si calcola che il corpo umano ne contenga circa 150.000 che rappresentano il 15 % del suo peso) ed esplicano in tutti gli organismi importanti funzioni biochimiche. Le proteine sono costituite da uno o più polipeptidi, polimetri di molecole più piccole, gli amminoacidi, cosiddetti perché contengono sia il gruppo amminico sia il gruppo carbossilico.
Il saggio delle proteine con biureto è una delle tecniche più comuni utilizzate nei laboratori di biochimica per determinare la presenza e la concentrazione delle proteine in una soluzione. Il principio chimico alla base del saggio delle proteine con biureto si basa sulla reazione tra il rame (II) solfato, presente nel reagente di biureto, e i legami peptidici delle proteine. Questo complesso colorato è il risultato dell’interazione tra il rame e i gruppi amminici presenti nei legami peptidici delle proteine. La reazione è specifica per i legami peptidici, il che significa che solo le molecole contenenti questi legami, come le proteine, reagiranno con il reagente di biureto.
Reagente di Biureto
Il campione contenente le proteine viene fatto reagire con il Biureto, un reattivo contenente rame (II) e tartrato di sodio e potassio. Per eseguire il saggio delle proteine con biureto, sono necessari diversi materiali e reagenti. Tra i principali troviamo il reagente di biureto, che è una soluzione di rame (II) solfato, idrossido di sodio e potassio tartarato. Oltre al reagente di biureto, sono necessari campioni di proteine da testare, che possono essere soluzioni standard di proteine note o campioni sconosciuti da analizzare. Altri materiali necessari includono pipette per la misurazione dei volumi, cuvette per la spettrofotometria, e un spettrofotometro per la misurazione dell’assorbimento della luce.
Preparazione del Reattivo
- Si preparano 300 ml di $NaOH$ al 10% m/V;
- si pesano separatamente 1,5 g di $CuSO_4$ e 6 g di Sodio e Potassio Tartrato;
- i due sali vengono disciolti nella soluzione di $NaOH$ al 10% (m/V);
- si porta a volume di 1L con acqua;
- conservare la soluzione al riparo della luce (contenitore scuro o avvolto in alluminio).
Il reattivo è così preparato in quanto il rame in soluzione, $Cu^{2+}$ in ambiente basico, dovrebbe precipitare come idrossido, $Cu(OH)_2$. La presenza del tartrato mantiene il rame in soluzione attraverso la formazione di un complesso in cui lo ione rameico centrale viene tetracoordinato dagli atomi di ossigeno delle funzioni carbossiliche. Il complesso impartisce alla soluzione una intensa colorazione blu.
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Procedura del Saggio
La procedura per eseguire il saggio delle proteine con biureto è relativamente semplice e può essere suddivisa in diversi passaggi chiave. Inizialmente, è necessario preparare i campioni di proteine e il reagente di biureto. Successivamente, si aggiunge una quantità specifica di reagente di biureto ai campioni di proteine. La miscela viene poi agitata delicatamente per assicurare una reazione uniforme. Dopo il tempo di reazione, la soluzione viene trasferita in una cuvetta e l’assorbimento della luce viene misurato tramite spettrofotometria a una lunghezza d’onda di circa 540 nm. Infine, i risultati ottenuti vengono confrontati con una curva di calibrazione preparata utilizzando soluzioni standard di proteine note.
Riferimento Positivo con Albume d'Uovo
- Rompere l’uovo ed estrarne solo l’albume;
- prelevare mediante una siringa circa 1 ml di albume e versarlo in un bicchierino di plastica;
- aggiungere 5 ml di acqua all'albume;
- versare la soluzione albume-acqua in un provettone (contenitore di vetro);
- inserire nella provetta, mediante l’uso di una siringa, 2 ml di reattivo di Biureto;
- miscelare energicamente;
- osservare la formazione di un cambiamento di colore della soluzione dal blu al viola, dovuta al fatto che il rame viene complessato dai gruppi funzionali della proteina.
La colorazione blu-viola in presenza di proteine è dovuta al fatto che gli ioni rameici del reattivo formano un complesso di coordinazione con gruppi NH (da due a quattro) appartenenti ad altrettanti legami peptidici. Per questo, il saggio sarebbe negativo con amminoacidi liberi e dipeptidi, mentre è positivo per tripeptidi, polipeptidi e molecole proteiche, in cui si ha un sufficiente numero di gruppi $-CONH^-$.
Riferimento Negativo con Acqua Distillata
Il riferimento negativo si può ovviamente considerare quello che si ottiene su acqua distillata, aggiungendovi due ml di reattivo: la colorazione intensa del reattivo mantiene la sua caratteristica tonalità azzurra.
Indagine: Quali Alimenti Contengono Proteine?
L'insegnante propone agli studenti un'attività di indagine basata sulla metodica sperimentale precedentemente messa a punto per testare la presenza o l'assenza di componente proteica in vari tipi di alimenti.
Preparazione dei Campioni (Sostanze Liquide)
- Prelevare mediante una siringa circa 1 ml di del campione e versarlo in un bicchierino di plastica;
- aggiungere 5 ml di acqua al campione;
- versare il campione in un provettone (contenitore di vetro).
Interpretazione dei Risultati
L’interpretazione dei risultati del saggio delle proteine con biureto si basa sulla misurazione dell’assorbimento della luce del complesso colorato. Per interpretare correttamente i risultati, è fondamentale confrontare i dati ottenuti con una curva di calibrazione. La linearità della curva di calibrazione è cruciale per garantire l’accuratezza del saggio. Inoltre, è importante considerare eventuali interferenze che possono alterare i risultati, come la presenza di altre sostanze che possono reagire con il reagente di biureto.
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Dopo due minuti registriamo i risultati nella tabella e stabiliamo se la soluzione considerata contiene proteine. Traggo le conclusioni solo in base alla presenza o all’assenza del colore violetto. Tra le soluzione analizzate hanno dato risultato positivo: il prosciutto (che è un tessuto muscolare), l’albume (che è il nutrimento indispensabile per gli uccelli in stadio di sviluppo [prima che si schiuda l’uovo]) e il Cracker Enervit (che è un particolare tipo di cracker che viene arricchito artificialmente di proteine). Le altre soluzioni osservate non contengono proteine polipeptidiche.
Vantaggi e Limitazioni
Il saggio delle proteine con biureto offre numerosi vantaggi, tra cui la sua semplicità e rapidità. Un altro vantaggio significativo è la specificità del saggio per i legami peptidici, che permette di determinare con precisione la concentrazione delle proteine. Tuttavia, il saggio biureto presenta anche alcune limitazioni. Una delle principali è la sensibilità relativamente bassa rispetto ad altre tecniche di quantificazione delle proteine, come il saggio di Bradford. Inoltre, il saggio può essere influenzato dalla presenza di altre sostanze che possono reagire con il reagente di biureto, causando interferenze nei risultati.
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