Il punto isoelettrico, o pH isoelettrico, è un valore che viene stabilito in biochimica, ovvero in quel ramo della scienza che si occupa dello studio della biologia e della chimica in relazione allo studio degli organismi viventi, fra cui l’uomo. Fra le macromolecole più importanti negli esseri viventi ci sono le proteine, che producono enzimi che sono in grado di innescare diverse funzioni nell’organismo.
Le proteine sono costituite da strutture complesse, ognuna delle quali è formata da una serie di amminoacidi. Questi sono legati fra loro da legami chimici di tipo peptidico (dal termine peptidi, sinonimo di amminoacidi). Questo tipo di legami possono essere più o meno complessi. Gli amminoacidi sono di moltissimi tipi e cambiano l’uno dall’altro per le strutture, le conformazioni dal punto di vista chimico e per la classe a cui appartengono.
Gli amminoacidi sono strutturati da un gruppo amminico, da un gruppo carbossilico, dal carbonio, dall’idrogeno ed eventualmente da un altro gruppo chiamato R (una catena laterale). Il punto isoelettrico (PI) è un valore di pH particolare, che coincide con il valore di pH in cui questa molecola ha una carica elettrica neutra. In quel momento la proteina è del tutto stabile.
Come Calcolare il Punto Isoelettrico di un Amminoacido
Il punto isoelettrico, indicato dalla sigla pI, è il valore del pH nel quale una data molecola presenta una carica elettrica pari a zero, cioè nulla. Esiste un pH al quale l'amminoacido è presente in forma di ione dipolare (zwitterione). Questo valore di pH (caratteristico per ciascun amminoacido) si chiama punto isoelettrico (o pH isoelettrico).
Per un amminoacido che ha solamente un gruppo amminico e un solo gruppo carbossilico, il valore del punto isoelettrico è determinato dalla media dei valori della pKa, ovvero della costante di dissociazione acida di ognuno dei due gruppi. La grande maggioranza di questi amminoacidi naturali hanno il gruppo amminico legato al carbonio in α rispetto al gruppo carbossilico.
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Per quelli amminoacidi invece in cui è presente più di un gruppo ionizzabile, come possono essere la lisina e l’aspartato, si usa la medesima formula ma con un elemento diverso. In questo caso, viene considerata solo la costante di dissociazione acida dei gruppi amminici e carbossilici che sono maggiormente presenti. Nella lisina ad esempio si contano solo i pKa del gruppo amminico, mentre nell’aspartato solo quello dei gruppi carbossilici.
Se gli amminoacidi presi in considerazione, hanno un pH inferiore al punto isoelettrico significa che hanno una forma cosiddetta protonata, cioè con carica positiva. Se il valore del pH invece è superiore al pI avranno forma deprotonata e quindi carica negativa. Il rapporto fra la quantità di un amminoacido deprotonato e protonato, ad un dato pH, si calcola col l’equazione di Henderson Hasselbalch.
In base al punto isoelettrico le proteine e gli amminoacidi possono essere separati mediante un processo di elettroforesi su gel, per questo il calcolo del pI è importante. Il principale utilizzo del punto isoelettrico e della modifica del pH è nel settore farmaceutico.
Casi Particolari: Calcolo del PI con Catene Laterali
Negli amminoacidi acidi e basici, bisogna anche prendere in considerazione la costante di dissociazione acida della catena laterale (gruppo R). La situazione infatti si complica un po’ se l’atomo del carbonio costituisce un centro chirale e attiva, ovvero se lega 4 atomi differenti e il gruppo R assume caratteristiche polari, quindi basiche o acide. La catena laterale in questo caso costituirà nel calcolo del punto isoelettrico, un terzo valore di costante di dissociazione acida (PKa).
Nel caso di un aminoacido con un gruppo carbossilico e uno aminico, il punto isoelettrico coincide con il valore di pH nel quale la carica elettrica tra le due funzionalità appena elencate è neutra. Per tutti gli aminoacidi senza residuo ionizzabile, il punto isoelettrico si calcola con la semplice media tra il pK carbossilico (pK1) ed il pK aminico (pK2). La glicina, ad esempio, è un aminoacido che presenta pK1 pari a 2.35 e pK2 pari a 9.78.
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Quando la catena laterale è protonabile, esiste un terzo valore di pK (pKr); il calcolo del punto isoelettrico, in questo caso, è operato in modo differente. È possibile assumere un buon esempio con il calcolo del pI della lisina, che è un aminoacido con tre gruppi ionizzabili: pK1 =2.16, pk2 = 9.06 e pK3 = 10.54.
Il punto isoelettrico si trova, necessariamente, tra i due valori di pK “estremi”, in altre parole 2.16 e 10.54. Il calcolo della media, di questi due valori, non è sufficiente poiché il pK2 può spostare la carica, in base al valore del pH, verso una forma elettropositiva o elettronegativa.
In linea generale, quando una molecola possiede un gruppo aminico, un gruppo carbossilico e un terzo residuo protonabile, il calcolo del punti isoeletrico viene svolto tenendo conto della media tra il pK aminoco (pK2) ed il pk del residuo pkR. Per spiegare il calcolo teorico del punto isoelettrico della lisina è opportuno proseguire lungo la linea concettuale degli estremi del pK.
Giacché a pH superiori a 2.16, pari al pK1, e inferiori a 10.54, pari al pK2, il gruppo carbossilico è maggiormente presente nella forma anionica (-COO-) e il gruppo aminico nella forma cationica (-NH3+) il punto isoelettrico deve essere calcolato in base ai valori di pK del gruppo aminico e del residuo protonabile laterale.
Effetti del pH sulle Proteine: Solubilità e Purificazione
Ad un determinato valore di pH, la proteina raggiunge il suo punto isoelettrico, ovvero di equilibrio. Le cariche positive insomma, bilanciano ottimamente le cariche negative. La molecola proteica non ha quindi carica netta e resta ferma in un campo elettrico. Ogni tipo di amminoacido ha il suo valore di pI.
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Proprio per questo motivo, la precipitazione isoelettrica è un tipo di tecnica per la purificazione delle proteine. La precipitazione consiste nel portare il pH della miscela di proteine ad un valore vicino a quello del punto isoelettrico. Se la solubilità diminuisce, essa potrà essere raccolta come precipitato. Sostanzialmente con questo metodo si può rendere una sostanza più o meno solubile.
Quando la proteina raggiunge un certo definito grado di purezza è anche possibile cristallizzarla, facendole formare agglomerati colloidali. Questo avviene quando si porta il pH della stessa al di sopra del suo punto isoelettrico con precipitanti specifici. Cristallizzazioni ripetute, possono portare ad una proteina sempre più pura.
Al punto isoelettrico pI non vi è alcuna migrazione netta di amminoacido, poiché la carica netta è uguale a zero. Il punto isoelettrico varia a seconda della natura del residuo -R. pH = 7,59 per l'istidina.
L’IEP o punto isoelettrico, di una proteina è il pH al quale la proteina non ha carica netta, o meglio le cariche positive sono della stessa entità di quelle negative. Sebbene la dimensione delle particelle e la sua misurazione siano intuitivamente familiari ai tecnologi delle particelle, il concetto del punto isoelettrico o di punto di carica zero (pzc) è meno ampiamente compreso e applicato.
Un amminoacido può esistere quindi in una forma completamente protonata (forma cationica) o in una forma completamente deprotonata (forma anionica).
Nello studio proposto tratto dal lavoro di M. Davranche and J. C. Bollinger, J. Colloid Interf.Sci. Wen, Q. Du and H. Tang, Environ. Sci. Il pzc potrebbe essere determinato anche per dispersioni di proteine o di collagene in acqua mediante titolazione potenziomentrica. Il pH finale è stato misurato e tracciato rispetto al pH iniziale.
Di conseguenza, i metodi descritti in questo documento sono stati applicati anche per solidi naturali e trattati con buona ripetibilità.
Tabella 1: Esempi di punti isoelettrici, pzc, pzse, pznpc e pznc per diversi materiali
| Materiale | Punto Isoelettrico (pI) | Punto di Carica Zero (pzc) | Punto Zero Effetto Sale (pzse) | Punto Zero Carica Netta Protonica (pznpc) | Punto Zero Carica Netta (pznc) |
|---|---|---|---|---|---|
| Esempio 1 | Valore pI | Valore pzc | Valore pzse | Valore pznpc | Valore pznc |
| Esempio 2 | Valore pI | Valore pzc | Valore pzse | Valore pznpc | Valore pznc |
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