Negli ultimi decenni, il rapido sviluppo tecnologico nel campo della biologia molecolare ha contribuito a spostare l'attenzione dei ricercatori dalla caratterizzazione di singole proteine allo studio di miscele proteiche molto complesse.
Da questo punto di vista, pertanto, la proteomica rappresenta una naturale evoluzione della chimica delle proteine.
In particolare, gli studi proteomici hanno tratto un enorme vantaggio dall'introduzione dei metodi soft di ionizzazione (ESI e MALDI) in spettrometria di massa, la quale è divenuta uno strumento indispensabile in proteomica.
Principi e Metodologie
Gli studi di proteomica prevedono la contemporanea caratterizzazione di diverse migliaia di proteine e, pertanto, richiedono l'utilizzo di una tecnica di separazione ad alto potere risolutivo (ad es. gel elettroforesi e cromatografia liquida) al fine di semplificare le complesse miscele da analizzare successivamente mediante spettrometria di massa.
La scelta del metodo di separazione, nonché della strategia da adottare, dipende sia dalla tipologia di proteine da analizzare, che dall'obiettivo finale da raggiungere.
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Tali studi possono essere condotti attraverso due differenti tipologie di analisi, note come "bottom-up" e "top-down".
Approccio Bottom-Up
Nell'approccio "bottom-up", la caratterizzazione della struttura primaria della proteina avviene mediante lo studio dei peptidi prodotti da reazioni di digestione enzimatica della proteina stessa.
In particolare, tale strategia prevede la separazione, visualizzazione e quantificazione dei singoli componenti di una miscela proteica mediante elettroforesi su gel, uno step di digestione enzimatica in-gel e la successiva fase di identificazione mediante spettrometria di massa e ricerca in banche dati.
D'altra parte, la digestione delle proteine presenti in miscela può essere effettuata senza alcuna preventiva separazione delle stesse.
Approccio Top-Down
La strategia "top-down" è una strategia d'analisi emergente che permette di ottenere contemporaneamente informazioni sulla massa di proteine intere, nonché dati (parziali) sulla sua sequenza aminoacidica.
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In particolare, le complesse miscele proteiche vengono preventivamente separate in singole proteine o in miscele meno complesse.
Questa fase è seguita da un'infusione diretta o un'analisi on-line (LC/MS) del campione in uno spettrometro di massa a ionizzazione ESI ad alta risoluzione per la misura della massa esatta delle proteine.
Attraverso la frammentazione (mediante metodi ETD o HCD) di ioni multi-carica delle proteine in esame, è inoltre possibile ottenere informazioni sulla loro struttura primaria, senza il ricorso a preventive reazioni di digestione enzimatica.
Analisi dei Dati
Indipendentemente dalla strategia utilizzata, i dati sperimentali vengono utilizzati per interrogare, mediante specifici tools bioinformatici (MASCOT, Ms-Fit, ProFound), le banche dati proteiche, genomiche e ESTs (expressed sequence tag), al fine di ottenere informazioni sulle proteine investigate.
Gas Utilizzati nella Spettrometria di Massa
La spettrometria di massa (MS) è un metodo analitico estremamente sensibile che viene spesso utilizzato in combinazione con altri metodi (ad esempio ICP-MS, GC-MS, IR-MS, CE-MS o EI-MS).
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I gas utilizzati nella maggior parte delle applicazioni della spettrometria di massa sono gas inerti come Elio, Azoto o Argon.
Questi gas vengono utilizzati per trasportare il campione nella camera di ionizzazione e per facilitare il trasferimento degli ioni nell'analizzatore di massa.
Il gas di esercizio viene utilizzato per creare un ambiente sottovuoto nello spettrometro di massa e per facilitare la ionizzazione delle molecole nel campione.
I gas comunemente utilizzati come gas di esercizio includono Elio, Argon e Azoto.
L'Elio è spesso preferito per il basso peso molecolare, la stabilità e l'ampia versatilità.
Tuttavia, a causa dei costi, è possibile che alcuni laboratori utilizzino l'Argon o l'Azoto come alternativa più economica.
È importante notare anche che alcuni tipi di spettrometria di massa, quali la spettrometria di massa con plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS), utilizzano gas specifici come l'Argon per ionizzare il campione.
La progettazione e l’installazione dell'impianto per la distribuzione dei gas sono due elementi che richiedono specifiche competenze tecniche finalizzate alla sicurezza e al mantenimento della purezza.
Infatti, la linea di distribuzione deve essere correttamente progettata e installata.
I gas devono essere puri (purezza e assenza di determinate impurezze, in particolare H20, CnHm…) e chimicamente inerti.
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