I membri della famiglia del coronavirus hanno protuberanze acuminate che sporgono dalla superficie delle loro buste esterne. Quelle protuberanze sono conosciute come proteine spike. Sono in realtà glicoproteine. Ciò significa che contengono un carboidrato (come una molecola di zucchero). Le proteine appuntite sono ciò che dà il nome ai virus. Esempi di coronavirus includono quelli che causano la sindrome respiratoria acuta grave (SARS) e la sindrome respiratoria mediorientale (MERS).
Le loro proteine a punta funzionano un po’ come grimaldelli che cambiano forma. Possono cambiare forma per interagire con una proteina sulla superficie delle cellule umane. Quelle proteine spike attaccano il virus a una cellula. Il 19 febbraio 2020, i ricercatori hanno descritto la struttura 3-D della proteina spike sul nuovo coronavirus dietro la pandemia globale del 2020.
Ciò ha confermato che anche la proteina spike del nuovo virus è un mutaforma. Inoltre, si aggrappa al suo bersaglio sulle cellule umane da 10 a 20 volte più strettamente di quanto fa la proteina spike della SARS allo stesso bersaglio. È stato uno dei primi sospetti su Sars-cov-2, e oggi sono sempre di più le prove che spingono gli scienziati a ipotizzare che Covid-19 possa avere una natura stagionale.
Non si tratta solo di intuito: un gruppo di ricercatori dell’Università dell’Illinois, negli Stati Uniti, imputerebbe al presunto comportamento stagionale della pandemia diversi fattori, tra cui una regione molecolare che risiede proprio nella proteina spike, la “chiave di ingresso” necessaria affinché il coronavirus infetti le nostre cellule. È quanto emerge dal lavoro pubblicato sulla rivista Methods in Microbiology: la proteina di Sars-cov-2 presenterebbe alcune caratteristiche strutturali che la renderebbero più capace di penetrare nelle cellule a temperature basse.
La scoperta potrebbe aiutare a prevedere mutazioni future e potenzialmente allo sviluppo di nuove terapie o di vaccini. Va da sé che comprendere le ragioni e le condizioni grazie a cui gli agenti microbici evolvono per diffondersi di più è considerata una sfida importante per il mantenimento della salute pubblica. Questo vale ancora di più in situazioni di emergenza come la pandemia di Covid-19: capire come Sars-cov-2 potrebbe comportarsi a determinate latitudini, stagioni o climi, è fondamentale per una gestione ottimale della situazione pandemica, oltre a suggerire interventi maggiormente mirati all’eliminazione del virus o alla prevenzione delle infezioni.
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Stagionalità del COVID-19 e la Proteina Spike
Effettivamente, fin dai primi mesi della pandemia, si è fatta avanti l’idea che Covid-19 avesse una certa stagionalità, in qualche modo simile a quella del raffreddore o dell’influenza. Ora, man mano che il tempo passa e che le ondate di infezioni si verificano con una cadenza temporale piuttosto prevedibile, diversi studi mettono in evidenza che anche la malattia da Sars-cov-2 potrebbe avere un andamento stagionale al pari di altre malattie respiratorie.
Gli studiosi suppongono che, alla base della sopravvivenza di Sars-cov-2, ci siano relazioni fortemente interconnesse tra ambiente, fisiologia del virus stesso e comportamento della popolazione (per esempio, l’apertura e la chiusura delle scuole). In particolare, secondo i ricercatori, queste tre componenti si regolano tra loro: ciò sarebbe possibile grazie a un componente molecolare di Sars-cov-2 che funzionerebbe da vero e proprio sensore ambientale e quindi anche come probabile responsabile della stagionalità del virus.
La Galectina e il Ruolo nella Proteina Spike
Si tratterebbe di una porzione della proteina spike di Sars-cov-2, responsabile di infettare le cellule e già obiettivo dei vaccini contro Covid-19. Spike, infatti, presenterebbe una particolare struttura proteica simile a quella di proteine note come lectine, prodotte da tutti gli organismi viventi e che nella cellula sono a capo di numerose funzioni. Recentemente i ricercatori hanno scoperto che alcune di esse svolgono un ruolo nel rilevamento dei cambiamenti di temperatura nell'ambiente: in particolare qualche anno fa uno studio sui coralli ha evidenziato come un particolare tipo di lectine, chiamato galectina, funzionava poco con i cambiamenti di temperatura dell'ambiente circostante.
Analizzando decine di migliaia di genomi di Sars-cov-2, i ricercatori hanno scoperto sulla proteina spike una struttura simile alla galectina: da qui l’ipotesi che questa porzione della proteina sia in grado di percepire le temperature esterne e, sia in grado - quando il termometro scende - di innescare un cambiamento nella conformazione di spike, facilitando l’ingresso del virus nelle cellule.
Non solo: i ricercatori hanno tenuto traccia delle mutazioni presenti nel genoma di Sars-cov-2 (che spesso si verificano nelle regioni responsabili dell’infettività e dei meccanismi di elusione del sistema immunitario) trovando che buona parte di esse fosse proprio a carico della porzione simile alla galectina.
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Questo ha consentito agli scienziati l'ipotesi di un modello stagionale di Covid-19, basato sul fatto che le mutazioni che portavano alle maggiori ondate di infezioni si verificassero durante l’inverno o in luoghi con clima fresco tutto l’anno. “Il monitoraggio della prevalenza delle mutazioni in questa struttura durante la della pandemia ha portato all'identificazione di un modello stagionale dipendente dall'emisfero terrestre guidato da esplosioni di infezioni dovute a mutazioni. Queste esplosioni sono responsabili dell'ascesa di Delta e di nuove varianti virali - dice Gustavo Caetano-Anollés, autore senior dello studio -.
La nostra è la prima proposta di un sensore virale che risponde ai modelli stagionali esterni dell'ambiente e della fisiologia. La proteina spike di SARS-CoV-2 è il principale meccanismo che il virus utilizza per infettare le cellule bersaglio; questa proteina è formata da due componenti principali: la subunità S1 e la subunità S2.
Subunità e Funzioni della Proteina Spike
La subunità S1 della proteina spike di SARS-CoV-2 è una regione molto flessibile e contiene il meccanismo chiamato RBD (dall’inglese receptor-binding domain, “dominio che lega il recettore”), attraverso il quale il virus è in grado di riconoscere e legare il recettore ACE2, che è la porta di ingresso del virus nelle cellule del nostro organismo. Per via della sua fondamentale importanza nel processo di infezione, la proteina spike di SARS-CoV-2 è uno dei bersagli farmacologici più studiati.
La pandemia in corso di COVID-19 ha imposto alla comunità scientifica di dedicarsi alla ricerca e sviluppo di varie strategie per combattere l’infezione da SARS-CoV-2. L’unico modo informato per identificare nuovi antivirali passa attraverso la conoscenza della struttura tridimensionale, letteralmente la forma, delle proteine del virus che sono responsabili dell’infezione delle cellule e della replicazione del virus.
Una tra le proteine bersaglio del virus più interessanti a questo scopo è la proteina Spike (S). Questa proteina decora la superficie del virus formando delle protuberanze caratteristiche (facendolo sembrare una corona - da cui il nome “Coronavirus”).
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Nel giro di due mesi dai primi casi di COVID-19, due gruppi di ricerca hanno determinato in modo indipendente la struttura della proteina Spike utilizzando la criomicroscopia elettronica, facendo vedere che essa è costituita da tre catene uguali associate (si dice che è “trimerica”) e costituita da una regione che somiglia al gambo di un fiore con, al posto della corolla, la regione essenziale per il contatto con le cellule da infettare (chiamato RBD, dall’inglese receptor-binding domain, “dominio che lega il recettore”). Questa parte della molecola è flessibile come una banderuola al vento, ed è in grado di “cercare” nei dintorni il recettore ACE2 con cui interagire.
SARS-CoV-2 possiede un genoma di 29.881 basi azotate, che codifica per 9.860 aminoacidi. Allo stato nativo (cioè quando il virus non sta infettando nessuno), la proteina spike è in forma di precursore inattivo. Il legame alla cellula ospite e la fusione della membrana virale (in sostanza del virus) con la membrana della cellula ospite sono fasi cruciali del processo di infezione.
La proteina Spike, una glicoproteina fondamentale nella struttura del virus SARS-CoV-2, ha suscitato grande interesse scientifico per il suo ruolo nelle infezioni e nei processi infiammatori. Approfondiamo insieme la sua composizione, le funzioni, e i suoi effetti sulla salute umana.
Cos'è la Proteina Spike?
La proteina Spike è una glicoproteina composta da due subunità, S1 e S2, unite da un ponte di-solfuro. Si tratta di un componente chiave del virus SARS-CoV-2, con diverse caratteristiche che ne determinano la pericolosità:
- Neurotossina: La Spike ha affinità con il tessuto nervoso, causando processi infiammatori patogenetici a carico dei nervi e del sistema nervoso.
- Antigene di superficie: È la "carta d'identità" del virus, essenziale per il riconoscimento da parte del sistema immunitario.
- Receptor Binding Domain (RBD): Questa regione, presente sulla subunità S1, funge da chiave di accesso per permettere al virus di infettare le cellule umane.
Come Funziona la Proteina Spike?
La Spike attiva una serie di processi fisiopatologici che hanno implicazioni cliniche significative:
- Attivazione della cascata coagulativa: La Spike si comporta come un fattore estrinseco della coagulazione, provocando trombosi e fenomeni tromboembolici. Coinvolgimento dei vasi del microcircolo, come i vasa vasorum e i vasa nervorum, con possibili conseguenze gravi, tra cui paralisi del nervo ipoglosso (deviazione della lingua), paralisi del nervo vago (arresto cardiaco), tromboembolia polmonare e microischemie encefaliche.
- Pancreatite, diabete, epatiti, encefaliti e vasculiti (manifestazioni cutanee come porpora e petecchie).
- IgG e IgM, rilevabili attraverso test diagnostici specifici. Questi test permettono di identificare la presenza della proteina Spike, sia come antigene di superficie virale durante l’infezione da SARS-CoV-2, sia come prodotto di stimolazione delle cellule in seguito alla vaccinazione con mRNA.
In sintesi, la proteina Spike rappresenta una sostanza estranea e potenzialmente dannosa per il corpo umano. La pandemia di COVID-19 attualmente in corso ha urgentemente spinto l’intera comunità scientifica a dedicare enormi sforzi, lavoro e risorse all’identificazione e allo sviluppo di nuove strategie farmacologiche per arrestare l’infezione da SARS-CoV-2 (di seguito indicato con CoV-2).
Struttura della Proteina Spike da SARS-CoV-2
Struttura della proteina Spike da SARS-CoV-2. Due catene sono rappresentate tramite la superficie molecolare che evidenzia la forma generale della molecola. La catena S1 è colorata in verde, con in rosso la porzione che serve ad interagire con il recettore ACE2 per infettare le cellule. La catena S2, che contiene la parte della molecola necessaria per l’ingresso del virus nella cellula, è colorata in giallo.
Come nell’arte della guerra, per poter sconfiggere il nemico è fondamentale conoscere: com’è fatto il virus, qual è la sua forma? Come infetta le cellule umane? Come cresce, replica e si sviluppa nelle cellule ospite? Di che cosa ha bisogno per sopravvivere? A molte di queste domande è già stato risposto. Ma come si possono ottenere queste informazioni senza poter vedere il nemico? Una particella virale e tutto il macchinario molecolare che usa per replicarsi e sopravvivere nelle cellule ospite non è né visibile a occhio nudo né usando un classico microscopio ottico.
È qui che entra in gioco la biologia strutturale, il cui scopo è proprio quello di identificare la struttura tridimensionale delle macromolecole biologiche, come le proteine e gli acidi nucleici, e di correlarla con la loro funzione fisiopatologica. Questa disciplina scientifica si basa su tecniche estremamente avanzate che consentono di visualizzare e analizzare molecole invisibili e di combattere invisibili agenti patogeni.
Nei prossimi paragrafi, partendo dalla descrizione dell’architettura complessiva del virus, verranno descritte le strutture delle tre protein di CoV-2 che sono considerate attualmente come i migliori bersagli farmacologici potenziali, ovvero la proteasi principale Mpro, la proteina Spike (S) e l’RNA polimerasi dipendente dall’RNA (RNA dependent RNA polymerase, RdRp). Verrà anche analizzata la relazione che lega le strutture di queste molecule alle loro funzioni fisiopatologiche.
Il primo isolamento documentato del CoV-2 a partire da campioni prelevati di pazienti infetti è stato realizzato all’ospedale Spallanzani di Roma e ha permesso di intraprendere lo studio del nuovo agente patogeno virale in diversi laboratori a livello internazionale. Le immagini delle particelle virali, isolate da persone di tutto il mondo, sono state ottenute usando un microscopio particolate che sfrutta elettroni anziché fotoni come sorgente di radiazione, ossia il microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Le proprietà ottiche degli elettroni rendono possibile osservare oggetti fino a 1-10 000 volte più piccoli di 1 µm (10−6 m).
Ora sappiamo che il CoV-2 fa parte, più nello specifico, dei β-coronavirus, costituiti da un RNA a singolo filamento con senso positivo (v. Il mondo sorpredente del genoma di SARS-CoV-2), di circa 29,9 kilobasi (kb; 1 kilobase = 1000 basi). Una particella virale (il virione) di CoV-2 ha un nucleocapside composto dall’RNA genomico e ricoperto da proteine fosforilate che interagiscono con la membrana virale durante l’assemblaggio del virione, giocando un ruolo critico nel potenziare la replicazione del virus.
L’RNA genomico e il nucleocapside sono avvolti da un doppio strato di fosfolipidi in cui sono immerse diverse proteine che svolgono ruoli cruciali per l’infezione e la replicazione: la proteina S, la proteina di membrana (M), l’emoagglutinina esterasi (HE) e la proteina del rivestimento (E).
Durante l’infezione della cellula ospite, il genoma virale agisce come RNA messaggero (v. Il mondo sorpredente del genoma di SARS-CoV-2) e dirige la sintesi di due grandi poliproteine (pp1a e pp1ab) che contengono al loro interno proteine più piccole necessarie alla produzione di nuove particelle virali all’interno delle cellule infette. Tale insieme di proteine comprende: un complesso di replicazione/trascrizione, diverse proteine strutturali necessarie a costruire virioni e due proteasi.
La Proteasi Principale Mpro
La protease principale di CoV-2, che effettua il maggior numero di tagli, pesa 33,8 kDa e si chiama Mpro, altrimenti conosciuta come proteasi 3C-simile (simile alla chimotripsina). La Mpro è fondamentale per la replicazione virale ed è assente nelle cellule umane. Il meccanismo di azione di Mpro è simile a quello di altre proteasi. Tutte le proteasi possiedono due residui amminoacidici chiave: un residuo attivatorio (di solito un’istidina, His) che rimuove protoni da un gruppo ossidrilico o tiolico della catena laterale di un secondo residuo (di solito una serina, Ser, o una cisteina, Cys) che agisce come potente nucleofilo, ossia un potente donatore di elettroni.
La catalisi inizia con la deprotonazione del tiolo (sostanzialmente un alcol in cui l’atomo di ossigeno è sostituito da un atomo di zolfo) della Cys145 da parte dell’His41, che è seguita dall’attacco nucleofilico della cisteina de-protonata al carbonio del legame peptidico della proteina substrato. Viene quindi rilasciata una proteina virale più piccola con terminale amminico libero, il residuo di istidina, His41, della proteasi recupera la sua forma de-protonata e si forma un intermedio tioestere che collega il nuovo carbossi-terminale del substrato al tiolo Cys145.
Successivamente, si forma un tioestere intermedio che lega il nuovo terminale carbossilico al tiolo della Cys145. Il tioestere è quindi idrolizzato per generare un terminale carbossilico sulla poliproteina rimanente, rigenerando l’enzima libero.
Jin e collaboratori hanno ottenuto la struttura cristallografica ad alta risoluzione della proteina Mpro in complesso con N3, una molecola nota per legare e inibire la proteasi principale di altri coronavirus, come SARS-CoV e MERS-CoV (codice di accesso in PDB: 6lu7). L’analisi della struttura mostra che la proteina appare come dimero, formato da due subunità identiche di 306 amminoacidi (A e B). I domini I e II hanno una tipica struttura a barile β in cui i filamenti β si dispongono in modo antiparallelo, mentre il dominio III è formato da cinque α-eliche. Il dominio III è unito al dominio II da un lungo ripiegamento (residui 185-200). Il sito di legame al substrato consiste in una cavità profonda che è posta in prossimità dell’interfaccia del dimero tra i domini I e II e contiene la diade catalitica Cys145-His41.
L’analisi della struttura ha consentito di capire che l’inibitore N3 lega fortemente la cavità dell’Mpro che normalmente alloggia il substrato, formando un legame covalente con la Cys145. Come la Mpro di SARS-CoV, quella di CoV-2 taglia le poliproteine pp1a e pp1ab in specifiche posizioni amminoacidiche, identificando i siti di taglio grazie a particolari “sequenze di base” nelle poliproteine.
La sovrapposizione di sequenze delle Mpro di 12 coronavirus, inclusi CoV-2, SARS-CoV e MERS-CoV, mostra che i residui che rivestono la tasca che lega il substrato sono fortemente conservati.
La struttura dell’Mpro di CoV-2 in complesso con l’inibitore N3 fornisce un modello e delle informazioni che possono essere usati per identificare altre molecole organiche capaci di legare la tasca catalitica dell’Mpro con più alta affinità, e condurre così allo sviluppo di nuovi farmaci antivirali specifici per il CoV-2.
Strategie Farmacologiche e Screening Virtuale
Una delle metodiche che è usata correntemente per identificare nuovi composti capostipiti è lo screening virtuale. Lo screening virtuale è una tecnica computazionale che permette di analizzare grandi numeri di dati (highthrouput screening) di librerie di migliaia di composti chimici, per identificare molecole che abbiano maggiori probabilità di legare il bersaglio farmacologico. Il legame del composto chimico al bersaglio viene simulato in silico (ossia in maniera totalmente predittiva), riducendo fortemente i costi, il tempo e lo sforzo rispetto allo stesso screening eseguito sperimentalmente.
Jin e collaboratori hanno usato proprio questa tecnica per identificare molecole con un volume corrispondente a quello della tasca catalitica dell’Mpro, partendo dalla sua struttura cristallografica in complesso con N3. Tutti i composti, tipicamente piccole molecole organiche, conservate in una specifica banca dati, sono stati testati in silico per individuare quelli che, date le proprietà geometriche e chimiche, potessero essere potenzialmente in grado di legare la Mpro nella tasca catalitica. Lo screening dei composti viene effettuato tramite programmi dedicati. In questo caso è stato usato Glide (versione 8.2).
Questa analisi ha portato all’identificazione di un composto, detto cinaserina, che ha mostrato il punteggio più alto e la modalità più sensata di legame alla tasca catalitica dell’Mpro. La cinaserina è un antagonista della serotonina molto ben caratterizzato, che è stato testato preliminarmente sugli esseri umani negli anni ’60 del Novecento e che ha mostrato di inibire l’Mpro di SARS-CoV. Di rilievo è il fatto che la cinaserina non è tossica per le cellule umane, mostrando una citotossicità del 50% a concentrazioni più alte di 200 μM, mentre è capace di inibire l’Mpro di CoV-2 a concentrazioni più basse (IC50=125 μM).
Infatti, una volta che un nuovo composto è identificato, viene inizialmente somministrato ad animali da esperimento, e successivamente agli esseri umani nel corso di sperimentazioni cliniche per testarne sicurezza ed efficacia. Possono volerci dai 10 ai 15 anni, o anche di più, per completare tutte le fasi di una sperimentazione clinica prima di giungere allo stadio di licenza di un nuovo farmaco.
Una strategia alternativa per accelerare i tempi è quella di testare l’attività di molecole esistenti e già approvate per altre patologie. Jin e collaboratori hanno applicato questa strategia per trovare velocemente farmaci contro COVID-19. Infatti, hanno analizzato oltre 10 000 composti come ligandi possibili della Mpro, inclusi farmaci già approvati, alcuni candidati per le sperimentazioni cliniche e anche dei prodotti naturali. Tra questi, hanno identificato un derivato del 5-fluorouracile, il Carmofur (1-hexylcarbamoyl-5-fluorouracil), che è risultato capace di legare ed inibire l’Mpro.
Il Carmofour è stato già approvato come farmaco antitumorale ed è usato per trattare il cancro del colon retto fin dal 1980. Sempre, Jin e collaboratori hanno risolto la struttura cristallografica dell’Mpro in complesso con il Carmofour, scoprendo le basi molecolari dell’efficacia del composto. In particolare, l’acido grasso di Carmofour lega la Cys145 attraverso un legame covalente, inibendo l’enzima.
La Proteina S e il Legame al Recettore dell'Ospite
I virus evolvono continuamente le proteine della loro superficie per potenziare l’interazione con i recettori sulle cellule ed entrare in esse con maggior efficienza secondo il modello chiave-serratura. La proteina S è una delle più interessanti e studiate tra quelle che contribuiscono al legame con il recettore dell’ospite e alla patogenesi virale. La proteina S “decora” la superficie del virus ed è responsabile per l’aspetto a corona della superficie virale, da cui il nome coronavirus. Questa è usata dal virus come una chiave per entrare nelle cellule ospite. Agisce legando il recettore sulle cellule bersaglio, induce l’endocitosi dei virioni e catalizza la fusione tra le membrane cellulari e virali, assicurando l’ingresso dell’RNA genomico virale nel citoplasma delle cellule.
La proteina S rappresenta anche il bersaglio principale del sistema immunitario, attivandolo e inducendo la produzione di anticorpi. Per questa ragione è considerata il bersaglio primario di farmaci antivirali e vaccini. L’organizzazione strutturale di CoV-2-S è molto simile a quella delle proteina S di altri coronavirus come SARS-CoV e MERS-CoV. Essa è una proteina trimerica transmembrana formata da tre unità identiche, dette protomeri.
La struttura della CoV-2-S è formata da tre proteine identiche (protomeri, rappresentati rispettivamente in verde, rosso e blu) assemblate in un trimero. Ogni protomero di CoV-2-S (per esempio, quello blu nella Figura 5) comprende due subunità funzionali: una responsabile per il legame al recettore sulle cellule bersaglio (la subunità S1) e l’altra coinvolta nella fusione con la membrane cellulare (subunità S2).
La CoV-2-S, come varie proteine spike di altri SARSr-CoV, è tagliata da proteasi cellulari al confine tra le subunità S1 ed S2, generando due regioni separate che rimangono legate in modo non covalente nella cosiddetta “conformazione di prefusione”. Infatti, CoV-2-S esiste in due differenti conformazioni, chiamate “su” (up) e “giù” (down) Nella conformazione “giù”, la CoV-2-S non può mediare la fusione della CoV-2 con la membrana della cellula ospite.